血清Adropin蛋白和腦啡肽酶在2型糖尿病視網膜病變患者中的變化及影響因素

張?？担顚毿?，李 娜，翟 娜，張云良，劉莉芳，王 翯，郭淑芹

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)作為糖尿病最常見的微血管并發癥之一，隨著病情的發展會逐漸影響人們的視力水平，也是不可逆性致盲最常見的病因。因此對DR的發生、發展機制及其影響因素的研究越來越引起人們的關注。有研究顯示，DR的發生、發展不僅與血糖控制水平，而且與血管內皮功能有著密不可分的關系[1]。Adropin蛋白(AD)是新發現的一類生物活性蛋白，由 76 個氨基酸組成，具有調節能量代謝、改善血管內皮細胞功能的重要作用[2]。而且有研究顯示，在糖尿病小鼠組血清中AD水平明顯低于非糖尿病小鼠組，表明AD在糖尿病的發生、發展中有一定作用[3]。腦啡肽酶(neprilysin，NEP)是位于細胞表面的Ⅱ型膜蛋白，是含鋅的金屬肽酶，在機體中廣泛存在，具有調節糖尿病患者血管內皮細胞功能的重要作用[4-5]。但是AD和NEP兩個因子在DR的發生、發展中是否起一定作用，以及二者相互作用關系尚未明確。因此本研究旨在觀察AD和NEP水平在不同程度DR患者血清中的變化并分析其影響因素，進而為研究DR的發生、發展機制提供理論依據。

1 對象和方法

1.1對象收集2017-10 /2019-01符合1999年WHO糖尿病診斷標準[6]并且于在保定市第一中心醫院內分泌科住院的2型糖尿病(T2DM)患者167例。所有受試對象均行散瞳，由2名有經驗的醫師行直接眼底鏡和眼底熒光血管造影檢查，根據臨床DR嚴重程度的分級標準[7]，將患者分為單純2型糖尿病組(DM組)59例，2型糖尿病合并視網膜病變組(DR組)108例，DR組包括非增殖期視網膜病變組(NPDR組)45例和增殖期糖尿病視網膜病組(PDR組)63例。另外選取于我院健康體檢者57例作為正常對照組(NC組)。納入標準：(1) 符合1999年WHO正常糖代謝、糖尿病和DR的診斷標準；(2) 能配合進行眼底檢查；(3) 同期的健康體檢者(符合正常糖代謝狀態并且既往無其他基礎病病史)。排除標準：(1) 糖尿病急性并發癥(糖尿病酮癥酸中毒，高血糖高滲狀態)；(2) 眼外傷及由其他原因引起的視網膜病變；(3) DR患者已行全視網膜激光光凝術；(4) 合并嚴重心、腦及血液等系統疾病及腫瘤；(5) 合并嚴重肝腎功能異常；(6) 合并其他基礎病。本研究獲保定市第一中心醫院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法收集并記錄所有研究對象的年齡(Age)、DM 病程，并測量其身高、體質量、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，計算體質量指數 (body mass index，BMI)，BMI=體質量/身高2(kg/m2)。所有研究對象均禁食8～10h后次日清晨采集空腹靜脈血(FPG)，以4000r/min 離心5～7min。采用日立7600生化儀器檢驗空腹靜脈血糖(fasting plasma glucose，FPG)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCR)采用糖化HA8180儀器檢驗糖化血紅蛋白(hemoglobin Alc，HbA1c)。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清AD(pg/mL)和NEP(U/L)水平，試劑盒購自上海酶聯免疫生物有限公司(Elabscien)。根據試劑盒說明書的指示，AD的有效檢測范圍是12.5～400pg/mL，NEP的有效檢測范圍是6.25～200U/L。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，結合試驗數據分析及試劑盒說明書顯示，兩因子批內變異系數均<10%，批間變異系數均<15%。

2 結果

2.1四組研究對象基本資料的比較四組研究對象的年齡、DBP比較差異無統計學意義(P>0.05)。與NC組相比，DM組、NPDR組、PDR組的BMI顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。DM組、NPDR組、PDR組的DM病程差異無統計學意義(P>0.05)。與NC、DM組相比，NPDR、PDR組的SBP明顯升高，PDR組明顯高于NPDR組(P<0.05)，見表1。

2.2四組研究對象血清生化檢查和相關指標的比較四組研究對象的TC、BUN、SCR、ALT、AST的差異無統計學意義(P>0.05)。與NC組相比，DM組、NPDR組、PDR組的TG水平明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)。四組間的FPG、HbA1c水平依次上升，均以PDR組最高，差異有統計學意義(P<0.05)，各組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。各組間NEP水平依次升高，以PDR組最高(P<0.05)，四組間的AD水平依次降低，其中以PDR組最低(P<0.05)，見表2。

表1 四組研究對象基本資料的比較

注：DM組：單純2型糖尿病組；NPDR組：非增殖期視網膜病變組；PDR組：增殖期糖尿病視網膜病組；NC組：健康體檢者。

表2 四組研究對象血清生化檢查和相關指標的比較

注：DM組：單純2型糖尿病組；NPDR組：非增殖期視網膜病變組；PDR組：增殖期糖尿病視網膜病組；NC組：健康體檢者。

表3 AD、NEP與各指標間的Pearson的相關分析

2.3血清AD、NEP水平與各相關因素Pearson相關分析根據Pearson相關分析，血清AD水平與DM病程、SBP、DBP、BMI、TG、FPG、HbA1c、NEP呈負相關(P<0.05或P<0.01)。血清NEP水平與DM病程、SBP、BMI、TG、FPG、HbA1c呈正相關(P<0.05或P<0.01)，與AD呈負相關(P<0.01)，見表3。

2.4血清AD、NEP水平多元線性回歸分析分別以AD、NEP為因變量，將Pearson相關分析后得出的差異有統計學意義的指標為自變量，行多元線性逐步回歸分析，結果顯示血清AD表達的顯著影響因素為FPG、HbA1c和NEP(P<0.05)，顯著影響NEP水平的因素為BMI、FPG、HbA1c和AD(P<0.05或P<0.01)，見表4、5。

3 討論

糖尿病視網膜病變已經成為嚴重影響我國公共健康的主要疾病之一，隨著DR的進展常常造成視力下降、視野缺損、玻璃體積血等損害，嚴重者甚至出現牽拉性視網膜脫離最終導致失明[8-10]。因此對于DR的早期診斷和干預越來越成為臨床醫學的研究熱點。本研究旨在以不同分期DR患者為主要研究對象，觀察血清AD和NEP水平在不同分期DR患者中的變化并分析其影響因素，為探究2型糖尿病視網膜病變的發生機制提供數據支持。

AD是一種由能量平衡相關基因(enho)編碼的調節蛋白，在肝臟和大腦中廣泛表達。有研究顯示，AD可以通過影響磷脂酰肌醇3-激酶-Akt和細胞外信號調節激酶這兩個通路，從而上調內皮NO合成酶的表達，進而增加上皮細胞NO的濃度起到血管內皮的保護作用[9]。不僅如此，有動物實驗顯示AD能顯著增加小鼠后肢缺血模型的血流量和毛細血管密度，從而改善機體缺血、缺氧狀態[11]。同時有研究顯示，AD還可通過降低促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α和白細胞介素6的mRNA表達，減少炎性因子的合成降低血液中炎性因子的濃度，從而減輕內皮細胞和單核細胞源性巨噬細胞的炎癥反應[12]。眾所周知，代謝的失衡、機體的炎癥反應、內皮細胞功能障礙、血管通透性增加和新生血管的生成是糖尿病微血管并發癥的基本過程，同時也是DR(尤其是PDR)的主要發病機制。上述研究顯示，AD在抑制炎癥反應和改善血管內皮功能有重要作用，因此我們不難推測AD可能對DR的發生和發展也有一定作用。一項觀察不同病程糖尿病患者血清AD水平的研究發現，2型糖尿病患者血清AD水平明顯低于正常對照組，并且隨著糖尿病病程的延長，AD水平逐漸降低[13]，與本研究測定結果一致。同時本研究進一步探究了不同時期DR患者血清中AD水平的變化，并分析其影響因素，發現隨著DR程度的加深血清AD水平逐漸減低，其中以PDR組最低，而且AD水平受到FPG、HbA1c及NEP的負向調節，表明AD水平對DR的發生、發展起負相關作用。而且另外一項研究發現，與DM組相比，PDR組和NPDR組患者血清和玻璃體中AD濃度明顯降低，并且以PDR組最低，表明血清和玻璃體中AD水平與DR進程呈負相關[14]。不僅如此，本次研究的Pearson的相關分析還顯示，年齡的增長、肥胖、長期血糖控制不佳和高血脂等因素都可能影響AD的水平。排除其他影響因素后分析得出，FPG、HbA1c、NEP是影響AD水平的獨立影響因素，而且NEP與AD呈明顯的負相關關系，表明二者有相互調節的關系，同時在DR的發生與發展中起一定作用。

表4 血清AD水平影響因素的多元線性回歸分析

表5 血清NEP水平影響因素的多元線性回歸分析

NEP是一種位于細胞表面依賴鋅離子的Ⅱ型膜蛋白，在心腦血管和其他組織中廣泛存在[15]。有研究表明，NEP主要通過降解或滅活許多生物活性肽，包括P物質、內皮素和心房利鈉肽等，從而影響血管內皮的功能[16]。而糖尿病患者血管內皮功能的改變、新生血管的生成、血管收縮缺氧導致的炎癥反應均為DR發生和發展的重要作用機制。另外有研究顯示，可以通過NEP 抑制劑的作用，增加機體利鈉肽的生物利用度，進一步對機體血管內皮功能起到調節作用[17-18]。而且在一項動物實驗中顯示，與對照組小鼠相比，通過NEP抑制劑處理過的小鼠整體血糖控制水平明顯改善，糖尿病的進程明顯減慢[19]。而且長期的血糖控制不佳和糖尿病病程的延長也是DR發生發展的重要因素，故我們可以推測NEP水平與DR的進展程度有相關性。一項臨床研究顯示，與正常對照組相比，2型糖尿病患者血清中NEP水平明顯升高，而且隨著糖尿病病程的延長，NEP水平逐漸升高，表明NEP水平與糖尿病的發生有關。本研究以正常受試者為對照組，測定血清NEP水平的變化，結果顯示DM組患者血清NEP水平明顯高于NC組，與上述研究結果一致，同時本研究進一步按照視網膜病變程度進行分組，發現隨著DR程度的加深，血清NEP水平逐漸升高以PDR組最高，提示NEP水平可能與DR的發生、發展有著密切的聯系。同時Pearson相關分析與多元線性回歸分析顯示，BMI、FPG、HbA1c、AD均為NEP水平的重要影響因素，表明NEP可能通過調節血糖的控制水平，調節機體代謝等作用與AD共同調節DR的發生和進展。

綜上所述，我們通過本次研究發現，隨著DR嚴重程度的進展，血清AD水平逐漸降低，NEP水平則逐漸升高，并且二者為負相關關系，表明AD和NEP可能通過不同的作用機制，以相反的作用方式來參與到DR發生和發展中，為以后進一步探究DR的發生機制提供了數據支持和理論依據。然而對于AD和NEP二者間具體的相互作用機制尚未明確，今后將進一步完善相關的基礎研究，進一步探討AD和NEP的相互影響機制。