基質細胞衍生因子-1及其受體CXCR4在翼狀胬肉中的表達及意義

劉倉倉,曹小彪,黃建波，高曉唯,任 兵,任紅燕，蔡 巖

0 引言

翼狀胬肉是一種呈翼狀增生并侵及角膜的良性纖維血管病變，其發病機制包括紫外線的生物學效應、免疫學說、成纖維細胞轉化、角膜緣干細胞移行學說、細胞凋亡等[1]。近來研究表明，翼狀胬肉的發生發展與新生血管有關[2]。研究發現基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor,SDF-1)通過與特異性受體趨化因子受體(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)結合，趨化CD34+細胞增殖并誘導血管生成，從而參與了許多血管新生性疾病的發病過程[3-4]。本研究探討翼狀胬肉組織中SDF-1/CXCR4在其發生和發展中的作用及其意義。

1 對象和方法

1.1對象

1.1.1標本的來源及收集收集2018-01/10在解放軍第四七四醫院行翼狀胬肉切除術的標本60例60眼，均來源于鼻側靜止期翼狀胬肉，男24例，女36例；其中年齡<50歲組30眼，年齡27～49(平均40.23±6.56)歲，年齡>50歲組30眼，年齡52～82(平均62.23±8.47)歲。納入標準：(1)按照診斷標準確診的位于鼻側靜止期的翼狀胬肉；(2)頭部長入角膜2～4mm。排除標準：(1)復發性翼狀胬肉；(2)活動性眼部炎癥；(3)假性翼狀胬肉；(4)單眼多發的翼狀胬肉。

同期收集視網膜脫離術或斜視矯正手術中切除的多余正常結膜組織30例30眼，其中男12例，女18例；年齡<50歲組15眼，年齡26～44(平均37.40±5.50)歲，年齡>50歲組15眼，年齡55～71(平均60.60±4.62)歲。納入標準：年齡相匹配單純孔源性視網膜脫離術或斜視矯正手術中患者的鼻側角鞏緣結膜組織。排除標準：(1)術眼或對側眼有翼狀胬肉或瞼裂斑；(2)既往有手術史；(3)術眼有角結膜病史；(4)術眼有外傷史者。所有翼狀胬肉患者均采用翼狀胬肉切除+自體球結膜移植術治療。兩組族別、性別、年齡、有無全身病及病史等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1、2。而室外工作者翼狀胬肉的患病率更高，差異具有統計學意義(P<0.05)。本項研究經中國人民解放軍第四七四醫院醫學倫理委員會批準(批文號：2014-倫審字-27)，所有患者均被告知并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器兔抗人SDF-1單克隆抗體(英國abcam有限公司)；山羊抗人CXCR4多克隆抗體(英國abcam有限公司)；SP兔二步法試劑盒(北京中杉金橋公司)、SP山羊二步法試劑盒(北京中杉金橋公司)、DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.2方法

1.2.1標本處理將收集的組織標本用生理鹽水沖洗干凈，用質量分數4%多聚甲醛溶液固定用于免疫組織化學檢測。

1.2.2免疫組織化學法檢測標本中SDF-1和CXCR4的表達將組織用石蠟包埋，行3μm連續切片，每個組織取5張切片，用作免疫組織化學染色和HE染色。石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，去除過氧化氫酶活性，微波修復，羊血清封閉，滴加兔抗人SDF-1單克隆抗體(稀釋濃度1∶100)或山羊抗人CXCR4多克隆抗體(稀釋濃度1∶150)，濕盒內4℃過夜；滴加生物素標記的二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。用已知的SDF-1和CXCR4陽性表達組織切片作為陽性對照；空白對照選用0.01mol/L PBS緩沖液代替一抗。置于顯微鏡下觀察標本的上皮細胞以及血管內皮細胞出現棕黃色顆粒為陽性表達，采用image-pro plus 6.0圖像分析軟件測量隨機5個視野的光密度值，取平均值，所得值為該區域的光密度值。HE染色切片了解組織的大體結構。

2 結果

2.1翼狀胬肉組織病理學特征顯微鏡下，正常結膜組織可分為上皮層和基質層，上皮層下基質層血管較疏松，有散在的毛細血管和少量的成纖維細胞和炎性細胞(圖1A,細箭頭所示)。翼狀胬肉組織的上皮層鱗狀上皮增生明顯，基質層有較多纖維組織和新生血管組織，伴有較多炎性細胞的浸潤(圖1B,細箭頭所示)，部分切片中還可看到嗜堿性物質和變性物質的存在(圖1C,粗箭頭所示)。

2.2 SDF-1和CXCR4在不同年齡的翼狀胬肉患者中的表達通過免疫組化方法，可以觀察到SDF-1和CXCR4蛋白在正常結膜中僅見上皮基底層細胞有少量陽性表達或不表達，而在翼狀胬肉組織的全層上皮細胞以及血管內皮細胞內均出現SDF-1和CXCR4陽性染色的棕黃色顆粒，見圖2、3。

2.3 SDF-1和CXCR4在不同年齡的翼狀胬肉患者中的平均光密度值SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉組織中的表達量明顯高于正常結膜組織，差異均有統計學意義(P<0.01，表3)。SDF-1在不同年齡翼狀胬肉組中的表達無明顯差異(P>0.05)，但是年齡<50歲組翼狀胬肉表達量的均值高于年齡>50歲翼狀胬肉組(表4)。年齡<50歲組翼狀胬肉CXCR4表達量高于年齡>50歲翼狀胬肉組，差異有統計學意義(P<0.01，表4)。不同年齡正常結膜的SDF-1和CXCR4的表達無明顯差異，差異均無統計學意義(P>0.05，表4)。

圖1正常結膜和翼狀胬肉的組織結構(HE染色×400)A：正常結膜，箭頭所示炎性細胞；B：小于50歲的翼狀胬肉患者，箭頭所示為炎性細胞；C：年齡大于50歲的翼狀胬肉患者，粗箭頭指變性物質。

圖2SDF-1在正常結膜和翼狀胬肉中的表達(免疫組織化學法×400)A：正常結膜；B：年齡<50歲的翼狀胬肉患者；C：年齡>50歲的翼狀胬肉患者。

表1 翼狀胬肉與正常結膜組患者的一般資料

注：-：表示采用Fisher確切概率法。

表2 不同年齡翼狀胬肉組間病史的差異性分析 眼(%)

表3 SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉與正常結膜組間的差異性分析

表4 SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉與正常結膜組不同年齡的差異性分析

圖3CXCR4在正常結膜和翼狀胬肉中的表達(免疫組織化學法×400)A：正常結膜；B：年齡<50歲的患者；C：年齡>50歲的患者。

2.4 SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉組織和正常結膜組織中表達的相關性翼狀胬肉患者中SDF-1蛋白和CXCR4蛋白進行Pearson相關性分析顯示兩者呈正相關(r=0.412，P=0.001)。正常結膜組織中SDF-1和CXCR4表達的平均光密度相關性分析顯示兩者呈正相關(r=0.946，P<0.001)。

3 討論

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，發生的主要環境因素是暴露于紫外線，這與我們的一般資料結果分析中室外作業者翼狀胬肉的發生率高結果一致[5]。正常人眼中鼻側結膜的血管低于其他位置的結膜血管(顳側、上方和下方)[6]，鼻側結膜更容易缺氧。發生缺氧損傷后，來自內皮細胞的缺氧誘導因子-1(hypoxia induced factor-1，HIF-1)導致體內SDF-1在缺血組織中的表達，SDF-1介導骨髓衍生的CXCR4的募集，將祖細胞表達到損傷部位，從而促進了翼狀胬肉的增生。

病理形態學觀察，正常結膜組織結構簡單，基質層細胞數量較少，翼狀胬肉中的炎性細胞數則明顯增多，成纖維細胞增殖活躍，且新生血管豐富，提示炎性細胞浸潤，成纖維細胞增殖，新生血管增生與翼狀胬肉的發生發展息息相關。

SDF-1是新近發現的一種趨化因子，主要在骨髓基質細胞中表達[7]，作為器官的修復器而引起人們的注意[8]，在人體的外周血細胞、內皮細胞、成纖維細胞和神經元中表達[9]。SDF-1將表達CXCR4的細胞募集到損傷部位來促進損傷愈合[10]。然而過量的SDF-1/CXCR4信號傳導能促進纖維血管瘢痕形成[11]，相反，抗SDF-1治療可減輕體內組織纖維化[12]。SDF-1可能通過雙重過程介導纖維血管瘢痕為特征的翼狀胬肉：SDF-1表達的上調和通過與CXCR4的相互作用參與肌成纖維細胞的轉化。SDF-1是眾所周知的CXCR4表達細胞的募集者[13]，因此，Kim等[12]認為CXCR4+細胞可能跨內皮遷移到翼狀肉中誘導纖維化而發生翼狀胬肉。他們還使用特異性CXCR4阻斷劑和SDF-1的小分子干擾RNA體外下調SDF-1/CXCR4的信號傳導通路，均降低了a-SMA表達。因此認為這種軸的下調可能潛在地暗示了翼狀胬肉成纖維細胞活性的可逆。Ding等[14]認為在SDF-1/CXCR4生物軸被抑制的條件下，肌成纖維細胞轉化可能不會完全受損。該假設推測其他機制可能參與翼狀胬肉的肌肉成纖維細胞轉化，并且還提出了在翼狀胬肉發生期間在體內早期抑制SDF-1/CXCR4軸的要求。

本研究免疫組織化學結果顯示SDF-1和CXCR4在在翼狀胬肉組織的整個上皮細胞以及血管內皮細胞內都出現棕黃色的陽性表達，以基底層細胞中表達更為突出，呈現明顯極性。在一些翼狀胬肉組織中在基質中的相同位置中檢測到SDF-1和CXCR4表達。此外，CXCR4+細胞主要在血管周圍區域被發現，也可見于血管內區域。SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉中的表達水平上調，提示SDF-1/CXCR4可能參與翼狀胬肉的形成。翼狀胬肉有較強的血管增生性，SDF-1和CXCR4可作為評判血管新生能力的重要指標。

用IPP6.0軟件分析光密度值，翼狀胬肉組織中SDF-1和CXCR4的平均光密度明顯高于正常結膜組織(P<0.05)，說明翼狀胬肉的發生發展與新生血管密切相關。年齡<50歲翼狀胬肉患者中CXCR4表達量高于年齡>50歲患者的表達量(P<0.05)，提示年輕患者的血管增生能力可能更強。而年齡<50歲翼狀胬肉患者中SDF-1表達量與年齡>50歲的患者表達量無明顯的統計學差異，但是年齡<50歲組翼狀胬肉表達量的均值高于年齡>50歲翼狀胬肉組(表4)，可能與樣本量相對較少有關。翼狀胬肉患者中SDF-1蛋白和CXCR4蛋白進行Pearson相關性分析顯示兩者呈正相關，這與Kim等[12]的研究結果相似，SDF-1是CXCR4+表達細胞的募集者，將CXCR4+細胞募集到傷口區域來促進損傷愈合。而正常結膜中SDF-1和CXCR4的表達相關更明顯，可能是由于SDF-1和CXCR4在正常結膜均不表達，其光密度值都為0或者光密度值都很小，或正常結膜組織中的樣本量較少造成的。

本研究初次研究了SDF-1和CXCR4在不同年齡的翼狀胬肉組織中的表達結果，研究有一定的局限，因此，這種現象需要通過骨髓衍生的細胞特異性標記物，基因敲除和通過大規模的研究，大量病例和體內動物實驗的進一步研究來驗證我們的結論。