凝膠法測(cè)定10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液C8-24Ve和30%脂肪乳注射液C14-24中細(xì)菌內(nèi)毒素

曾博雅

摘 要 目的：采用凝膠法測(cè)定10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（C8-24Ve）和30%脂肪乳注射液（C14-24）中的細(xì)菌內(nèi)毒素。方法：根據(jù)《中國(guó)藥典2015年版四部》1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，先調(diào)節(jié)供試品pH值，再進(jìn)行干擾試驗(yàn)，確定10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液8倍稀釋液無(wú)干擾作用，30%脂肪乳注射液原液無(wú)干擾作用。結(jié)果：在調(diào)節(jié)pH值至中性后，10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液8倍稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾，30%脂肪乳注射液原液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾。結(jié)論：凝膠法可用于10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（C8-24Ve）和30%脂肪乳注射液（C14-24）中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

關(guān)鍵詞 中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液;脂肪乳注射液;細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法;凝膠法

中圖分類(lèi)號(hào)： R927文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.02.058

近年來(lái)，10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液作為腸外營(yíng)養(yǎng)藥，用于口服或腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不能或不夠時(shí)補(bǔ)充能量和必需脂肪酸。30%脂肪乳注射液是能量補(bǔ)充藥，是靜脈營(yíng)養(yǎng)的組成部分之一，為機(jī)體提供能量和必需脂肪酸，用于胃腸外營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充能量及必需脂肪酸，預(yù)防和治療人體必需脂肪酸缺乏癥，也為經(jīng)口服途徑不能維持和恢復(fù)正常必需脂肪酸水平的病人提供必需脂肪酸。30%脂肪乳注射液更適合輸液量受限制和能量需求高度增加的病人。其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。因其是靜脈輸注，所以要測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素含量，確保在規(guī)定范圍內(nèi)，防止熱原反應(yīng)，以保證產(chǎn)品的品質(zhì)和質(zhì)量。本文采用凝膠法對(duì)10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（C8-24Ve）和30%脂肪乳注射液（C14-24）中細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢查。

1 試驗(yàn)藥品試劑及儀器

10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（C8-24Ve）（西安立邦制藥有限公司，批號(hào)：1808262，規(guī)格：250ml）; 30%脂肪乳注射液（C14-24）（西安立邦制藥有限公司，批號(hào)：1807082，規(guī)格：250ml）;鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：1701190，靈敏度0.06EU/ml; 批號(hào)：1703141，靈敏度0.5EU/ml）;細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：1704100）;細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-201783，效價(jià)：80EU/支）。智能恒溫加熱儀;梅特勒PH測(cè)試儀;渦旋混合儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH04342012》和《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品二部第六冊(cè)》，兩種注射劑均為每1ml中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5EU。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核

根據(jù)《中國(guó)藥典2015年版四部》[1]1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。

使用靈敏度為0.5EU/ml的鱟試劑。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用檢查用水溶解稀釋制成1、0.5、0.25、0.125EU/ml四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16支分別加入0.1ml上述不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4支;另外2支加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。加樣完成后，在渦旋混合儀上輕劃三下混勻，封口膜包覆管口，豎直放入37℃的智能恒溫加熱儀中，保溫60分鐘。

使用靈敏度為0.06EU/ml的鱟試劑。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用檢查用水溶解稀釋制成0.125、0.06、0.03、0.015EU/ml四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述方法一組四個(gè)平行樣，陰性對(duì)照兩個(gè)樣。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1結(jié)果表明，鱟試劑復(fù)核結(jié)果均在0.5～2λ，靈敏度符合規(guī)定。

2.3 調(diào)節(jié)pH值

根據(jù)廠(chǎng)家經(jīng)驗(yàn)，脂肪乳注射液的pH值一般在8左右，經(jīng)PH計(jì)測(cè)定，此10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（C8-24Ve）的pH值為7.930，30%脂肪乳注射液（C14-24）的pH值為8.406，我們用配置好的鹽酸調(diào)節(jié)pH值。將1ml濃鹽酸加入到4ml的檢查用水中，共計(jì)5ml，為酸性調(diào)節(jié)劑，配置過(guò)程所用的器皿都為滅過(guò)內(nèi)毒素的。加一滴酸性調(diào)節(jié)劑到整瓶10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（C8-24Ve）的供試品中，搖勻，倒出一小杯，再次測(cè)定其pH值為7.391，為中性。

加兩滴酸性調(diào)節(jié)劑到整瓶30%脂肪乳注射液（C14-24）的供試品中，搖勻，倒出一小杯，測(cè)定其pH值為7.808，還未到中性，再加一滴酸性調(diào)節(jié)劑到整瓶30%脂肪乳注射液（C14-24）的供試品中，搖勻，倒出一小杯，測(cè)定其pH值為7.390，為中性。調(diào)節(jié)好PH的供試品作為供試液進(jìn)行下列試驗(yàn)。

2.4 干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《中國(guó)藥典2015年版四部》1143進(jìn)行試驗(yàn)，取10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（C8-24Ve）和30%脂肪乳注射液（C14-24）調(diào)節(jié)好PH的供試品，使用靈敏度為0.5EU/ml的鱟試劑，分別用檢查用水將供試品配制成原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液、8倍稀釋液，供試品陽(yáng)性對(duì)照為每一稀釋倍數(shù)下，該供試品稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ（1EU/ml）濃度，陽(yáng)性對(duì)照為檢查用水制成的2λ（1EU/ml）內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，陰性對(duì)照為檢查用水。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2結(jié)果表明，10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液8倍稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)o干擾，可使用8倍稀釋液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。30%脂肪乳注射液原液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)o干擾，可使用原液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

同時(shí)，用不調(diào)節(jié)pH值的10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（C8-24Ve）供試品原液進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用靈敏度為0.06EU/ml的鱟試劑，用檢查用水將供試品配制成8倍稀釋液，陽(yáng)性對(duì)照為0.125EU/ml內(nèi)毒素溶液，供試品陽(yáng)性對(duì)照為以供試品液稀釋的0.125EU/ml的內(nèi)毒素溶液，陰性對(duì)照為檢查用水。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

用不調(diào)節(jié)pH值的30%脂肪乳注射液（C14-24）供試品原液進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用靈敏度為0.5EU/ml的鱟試劑，取原液，陽(yáng)性對(duì)照為1EU/ml內(nèi)毒素溶液，供試品陽(yáng)性對(duì)照為以供試品液稀釋的1EU/ml的內(nèi)毒素溶液，陰性對(duì)照為檢查用水。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3結(jié)果表明，10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液調(diào)節(jié)pH值后的供試品8倍稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)o干擾，應(yīng)用調(diào)節(jié)pH值后的供試品作為供試液。30%脂肪乳注射液調(diào)節(jié)pH值后的供試品原液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)o干擾，應(yīng)用調(diào)節(jié)pH值后的供試品作為供試液。

2.5 干擾試驗(yàn)

根據(jù)《中國(guó)藥典2015年版四部》1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液，使用靈敏度為0.06EU/ml的鱟試劑，將調(diào)節(jié)過(guò)pH值的供試品制成8倍稀釋液，用檢查用水將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.125、0.06、0.03、0.015EU/ml，另用8倍稀釋液將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.125、0.06、0.03、0.015EU/ml。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

30%脂肪乳注射液，使用靈敏度為0.5EU/ml的鱟試劑，將調(diào)節(jié)過(guò)pH值的供試品，用檢查用水將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1、0.5、0.25、0.125EU/ml，另用調(diào)節(jié)過(guò)pH值的供試品原液將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1、0.5、0.25、0.125EU/ml。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4結(jié)果表明，10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液在調(diào)節(jié)pH值后，8倍稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾。30%脂肪乳注射液在調(diào)節(jié)pH值后，原液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾。

2.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液，按照限值0.5EU/ml，使用靈敏度為0.06EU/ml的鱟試劑，用自配的鹽酸調(diào)節(jié)供試品pH值，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。30%脂肪乳注射液，按照限值0.5EU/ml，使用靈敏度為0.5EU/ml的鱟試劑，用自配的鹽酸調(diào)節(jié)供試品pH值，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5結(jié)果表明，該批10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。符合規(guī)定。該批30%脂肪乳注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。符合規(guī)定。

3 結(jié)果

10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液在調(diào)節(jié)pH值至中性后，8倍稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾。該批供試品檢查結(jié)果符合規(guī)定。

30%脂肪乳注射液在調(diào)節(jié)pH值至中性后，原液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾。該批供試品檢查結(jié)果符合規(guī)定。

4 討論

《中國(guó)藥典2015年版四部》1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法有兩種方法，包括凝膠法和光度測(cè)定法，光度測(cè)定法又包括濁度法和顯色基質(zhì)法。脂肪乳注射液現(xiàn)企業(yè)多采用顯色基質(zhì)法進(jìn)行測(cè)定。但凝膠法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，適用范圍廣，為第一法，也是我國(guó)法定仲裁法[2]。有報(bào)道[3-5]，中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液對(duì)鱟試劑凝集反應(yīng)有干擾作用。中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液含有大豆油、中鏈甘油三酸酯、卵磷脂[6]、甘油等成分，影響因子多，供試品陽(yáng)性對(duì)照不容易凝的好。可能是與其所帶電荷干擾鱟試劑凝集反應(yīng)有關(guān)[2]。本實(shí)驗(yàn)先調(diào)節(jié)供試品的pH值，使其呈中性，可能是使其所帶電荷趨于穩(wěn)定，減少干擾作用。再將10%中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液供試品稀釋至8倍，使用靈敏度為0.06EU/ml的鱟試劑，無(wú)干擾作用。

而30%脂肪乳注射液供試品原液，無(wú)需稀釋?zhuān)♂尯蠊┰嚻逢?yáng)性反而凝的不好，可能是由于脂肪乳注射液含有大豆油、卵磷脂、甘油等成分，其較多油性成分，稀釋時(shí)加入檢查用水，形成油水混合，反而破壞了穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用靈敏度從高的到低的鱟試劑，供試品陽(yáng)性凝的越來(lái)越好：0.03EU/ml鱟試劑，供試品陽(yáng)性呈水狀，水油分層，形成不了凝膠。使用0.06EU/ml鱟試劑，供試品陽(yáng)性呈半凝固狀。使用0.125EU/ml鱟試劑，供試品陽(yáng)性剛開(kāi)始呈凝膠狀，緩慢倒轉(zhuǎn)180°還是會(huì)滑脫。只有使用0.5EU/ml鱟試劑，供試品陽(yáng)性呈穩(wěn)定的白色凝膠狀，緩慢倒轉(zhuǎn)180°不變形，不從管壁滑脫。因此30%脂肪乳注射液在調(diào)節(jié)pH值至中性后，原液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1143.

[2]王文佳，陳志明，張納敏，等.凝膠法測(cè)定脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素.[J]中國(guó)藥房，2017，28（18）：2576-2578.

[3]李雪蘭，黃新蘭，翟艷，等.脂肪乳注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2010，8（11）：53-54.

[4]余洋，趙志龍，戴政寧.長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（00）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志，2016，3（23）：4704-4705.

[5]賈旭明，黃明.鱟試驗(yàn)測(cè)定長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法學(xué)研究[J].四川生理科學(xué)雜志，2008，30（4）：158-159.

[6]王汝濤，陳濤，王惟嬌.國(guó)產(chǎn)卵磷脂輔料對(duì)脂肪乳制劑質(zhì)量的影響研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2007，16（23）：5-6.