HPLC法同時測定牛黃清胃丸中四種成分的含量

于文萃，高毓濤

(1.遼寧地質工程職業學院，遼寧 丹東 118000；2.丹東市市場監管事務服務中心，遼寧 丹東 118002)

牛黃清胃丸具有清胃瀉火，潤燥通便的功效.臨床用于心胃火盛，頭暈目眩，口舌生瘡，牙齦腫痛，乳蛾咽痛，便秘尿赤等癥候.其制劑標準收載于《衛生部藥品標準》第一冊(中藥成方制劑)，處方由人工牛黃、大黃、菊花、麥冬、薄荷、石膏、梔子、玄參、番瀉葉、黃芩、甘草、桔梗、黃柏、連翹、牽牛子(炒)、枳實(沙燙)、冰片等17味中藥組成.現代研究[1-2]表明，方中的大黃、番瀉葉主要有效成分為蒽醌及其衍生物，具有破氣除脹，清熱瀉火，倒滯通便的功效.其中含有已知的主要蒽醌類活性成分為大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等，具有抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管、調節肝腎功能等多種臨床功效[3-6].由于該產品制劑的質量標準中并未對其有效成份進行監測，為了更好的控制牛黃清胃丸(水蜜丸)質量，本文參考相關文獻[7-15]，建立同時測定牛黃清胃丸中大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的HPLC法，為本制劑質量控制提供更可靠的方法依據.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10AT高效液相色譜系統，島津SPD-10A(UV-Vis Detector)，島津Labsolution色譜工作站.

1.2 試藥

牛黃清胃丸(規格:水蜜丸，每袋7 g，長春人民藥業集團有限公司)；對照品：大黃酸(批號：110757-200206)，大黃素(批號：110756-200110)，大黃酚(批號：110796-201319)，大黃素甲醚(批號：110758-201114)(均由中國藥品生物制品檢定研究院提供)；水為純化水，甲醇為色譜純，磷酸為分析純.

2 方法、結果與討論

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取大黃酸對照品22.68 mg，大黃素對照品15.62 mg，大黃酚對照品18.42 mg，大黃素甲醚對照品13.06 mg，分別置于10 mL、50 mL、25 mL、50 mL量瓶，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻.精密量取大黃酸對照品溶液5 mL，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品溶液各10 mL，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含226.80 μg·mL-1大黃酸、62.48 μg·mL-1大黃素、147.36 μg·mL-1大黃酚、52.24 μg·mL-1大黃素甲醚的混合對照品儲備液，精密量取上述對照品儲備液2.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得.

2.2 供試品溶液的制備

取本品1袋，研細，精密稱取2.502 g置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，超聲提取30 min (功率125 W，頻率53 kHz)，濾過，殘渣用少量甲醇洗滌3次，合并濾液于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，即得.

2.3 色譜條件及系統適用性試驗

用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸(75：25)為流動相等度洗脫；柱溫為30 ℃；進樣量10 μL；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為254 nm.陰性對照樣品(按廠家處方購置不含大黃、番瀉葉的藥材飲片，粉碎，精密稱取約2.5 g，加甲醇50 mL超聲提取30 min，過濾得陰性對照溶液)、對照品及供試品色譜圖(見圖1、2、3).在該色譜條件下，理論塔板數分別按大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰計算均不低于5 000，分離度均符合要求.

t/min圖1 陰性對照樣品色譜圖

t/min圖2 混合對照品HPLC色譜圖

t/min圖3 供試品HPLC色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍

精密量取“2.1”項下的混合對照品儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得對照品系列溶液.按“2.3”項下的色譜條件進行測定，以峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程見表1.

表1 牛黃清胃丸回歸方程與線性范圍(n=5)

2.4.2 精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，在2.3項下色譜條件下，重復進樣6次，記錄色譜圖，大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚RSD值分別為0.7%、0.5%、0.4%、0.6%(n=6).

2.4.3 穩定性試驗

精密稱取同一批牛黃清胃丸細粉，，按“2.2”的方法制備，分別于0、2、4、8、12、16、24 h測定，記錄色譜圖，大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.6%，0.8%，0.7%，0.6%(n=7).

2.4.4 重復性試驗

精密稱取同一批牛黃清胃丸細粉，按“2.2”的方法制備，按“2.3”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，按外標法計算，平行進樣6次，大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均含量分別為1.12、0.31、0.74、0.26 mg·g-1；RSD分別為0.4%、0.6%、0.8%、0.5%(n=6).

2.4.5 陰性對照試驗

按廠家處方精密稱取不含大黃、番瀉葉藥材的陰性對照樣品細粉，按“2.2”的方法制備，按“2.3”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果在大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對應的保留時間處未見色譜峰，說明樣品中的其他成分對上述4個成分無干擾.

2.4.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量(大黃酸1.12 mg·g-1，大黃素0.31 mg·g-1，大黃酚0.74 mg·g-1，大黃素甲醚0.26 mg·g-1)的牛黃清胃丸(批號：20151201)細粉6份，按2.2項下方法制備樣品溶液，稱樣量減半并隨機分為3組，每組2份樣品，分別加入2.1項下的混合對照品儲備液5.0、6.0、7.0 mL，用甲醇稀釋至刻度，按2.3項下的色譜條件測定，計算回收率，結果見表2.

表2 牛黃清胃丸加樣回收率試驗結果(n= 6)

2.5 樣品含量測定

取本品1個生產廠家共計3個批次的藥品按“2.2”的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以外標法按峰面積計算含量，結果見表3.

表3 不同批次牛黃清胃丸樣品中4個成分含量測定結果(mg·g-1，n=3)

2.6 討論

本文綜合考慮牛黃清胃丸中的大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4種成分的紫外吸收特性，在波長254 nm處，待測組分與其它雜質峰基本分離，靈敏度高，因此確定254 nm為檢測波長.同時采用甲醇-0.1%磷酸作為流動相洗脫系統，通過不斷的調試兩相的比例，結果在甲醇-0.1%磷酸(75：25)時，4種組分得到了充分分離，且峰型良好.我們也考察了不同品牌的色譜柱，分離重現性良好.

3 結 論

大黃和番瀉葉是牛黃清胃丸瀉火通便功效的主要配方組分，其主要化學成分為蒽醌類化合物及其衍生物，本文利用HPLC法對其游離蒽醌主要成分大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚同時進行分析測定，該方法操作簡便、結果準確，靈敏度高、重復性好，可作為牛黃清胃丸中大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4種成分的質量控制方法.