氮肥用量優化對甜玉米氮肥吸收利用率及氮循環微生物功能基因的影響

徐如玉　左明雪　袁銀龍　孫杰　顧文杰　盧鈺升　解開治　徐培智

摘要：【目的】研究氮肥用量優化對甜玉米氮肥利用率及根際土壤氮循環微生物功能基因的影響，為農業生產中氮肥減施及高效利用提供參考。【方法】在磷、鉀肥用量優化一致的基礎上，設3個施氮水平：（1）對照，不施氮;（2）常規施氮水平，氮用量420 kg/ha;（3）優化施氮水平，氮用量330 kg/ha。玉米成熟期采集植株樣品及土壤樣品，采用常規分析、根際土壤高通量測序和功能基因芯片（GeoChip 5.0）技術，對不同氮肥用量處理甜玉米產量、可溶性糖含量、土壤氮肥利用率、細菌群落結構及氮循環功能基因進行分析。【結果】與對照相比，優化施氮水平與常規施氮水平均能顯著提高甜玉米鮮苞產量（P<0.05，下同），但二者間無顯著差異（P>0.05，下同），優化施氮水平的可溶性糖含量最高（122.2 mg/kg），顯著高于常規施氮水平（113.8 mg/kg），氮肥吸收利用率和氮肥偏生產力也分別較常規施氮水平處理提高8.5%（絕對值）和7.7 kg/kg。9個土壤樣品16S rRNA高通量測序共檢測到144736個OTUs，分屬于46門106綱213目289科404屬。優化施氮水平與氮循環相關的固氮菌屬Rhodanobacter和Bradyrhizobium的相對豐度高于常規施氮水平，而氨氧化細菌Bryobacter和硝化作用細菌Candidatus_Nitrocosmicus的相對豐度則低于常規施氮水平。采用GeoChip 5.0技術在9個土壤樣品中共發現了2752個氮循環基因，分屬于8個亞類功能。其中固氮、氨化、硝化、同化氮還原、氮同化和異化氮還原等作用表現為優化施氮水平高于常規施氮水平，除固氮作用外，兩個處理間差異顯著;氨氧化作用表現為常規施氮水平高于優化施氮水平，但兩個處理間差異不顯著。【結論】氮肥用量優化有助于調控參與氮循環關鍵環節的細菌菌屬豐度，促進氮循環微生物功能基因的固氮作用和氨化作用，提高土壤氮肥吸收利用率和甜玉米可溶性糖含量，且甜玉米鮮苞產量與常規施氮水平相當，在氮肥減量增效的同時達到甜玉米穩產提質的效果，可作為推薦施肥方式進行推廣應用。

關鍵詞： 甜玉米;氮肥用量;根際土壤氮循環;細菌群落;高通量測序;功能基因芯片

中圖分類號： S143.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-2919-08

Abstract：【Objective】To study the effects of nitrogen fertilizer application optimization on nitrogen fertilizer utilization efficiency and microbial functional genes of nitrogen cycle in rhizosphere soil of sweet corn， and to provide reference for nitrogen fertilizer reduction and efficient utilization in agricultural production. 【Method】The optimized dosages of phosphorus and potash fertilizer were the same， three nitrogen application levels were set in this experiment ：（1） control， no nitrogen application;（2）conventional nitrogen application level， nitrogen dosage 420 kg/ha;（3） the nitrogen application level was optimized， and the nitrogen dosage was 330 kg/ha. Plant samples and soil samples were collected during maize maturity. The yield， soluble sugar content， soil nitrogen utilization efficiency， bacterial community structure and nitrogen cycle function genes of sweet corn treated with different nitrogen fertilizer dosages were analyzed by conventional sweet corn index analysis， high throughput sequencing of rhizosphere soil and GeoChip 5.0 technology. 【Result】Compared with the control， the results of this study showed that both optimized and conventional nitrogen levels could significantly increase the fresh ear yield of sweet corn （P<0.05， the same below）， there was no significant difference between the fresh ear yield of sweet corn treated with optimized nitrogen application level and that treated with conventional nitrogen application level（P>0.05，the same below）. The soluble sugar content was the highest in the treatment with optimized nitrogen application level（122.2 mg/kg） which was significantly higher than the conventional nitrogen application level（113.8 mg/kg）. The results showed that the nitrogen recovery efficiency and nitrogen partial productivity were increased by 8.5%（absolute value） and 7.7 kg/kg. At the same time， 144736 OTUs were detected after 16S rRNA high-throughput sequencing was performed on 9 soil samples， which belonged to 404 genera， 289 families， 213 orders， 106 classes and 46 phylum. The results of relative abundance of Rhodanobacter and Bradyrhizobium were higher than that of conventional nitrogen application， while the results of relative abundance of Bryobacter and Candidatus_Nitrocosmicus were lower than that of conventional nitrogen application. A total of 2752 nitrogen cycle genes were found in 9 soil samples using GeoChip 5.0 technology， and the functions of these genes were divided into 8 subclasses. The effects of nitrogen fixation， ammoniation， nitrification， nitrogen assimilation reduction， nitrogen assimilation and nitrogen alienation reduction on nitrogen substances were shown as that the optimized nitrogen application level treatment was higher than the conventional nitrogen application level treatment. Except biological nitrogen fixation， the difference between the two treatment groups was significant. The effect of ammonia oxidation mainly showed that the conventional nitrogen application level treatment was higher than the optimized nitrogen application level treatment， but the difference between the two treatment groups was not significant. 【Conclusion】The improvement of the amount of nitrogen fertilizer used in crops can help regulate the bacterial species abundance of crops that participate in the key link of the nitrogen cycle， so as to promote the nitrogen fixa-tion and ammoniation of microbial functional genes in the nitrogen cycle， ultimately improve the uptake and utilization rate of nitrogen fertilizer in plant soil and soluble sugar content of sweet corn， and the fresh ear yield of sweet corn is equivalent to that of conventional nitrogen application level， which can achieve the effect of stable yield and quality improvement of sweet corn while reducing nitrogen fertilizer and increasing efficiency. This treatment can be promoted as a recommended fertilization mode.

Key words： sweet corn; nitrogen fertilizer dosage; nitrogen cycle in rhizosphere soil; bacterial community; high-throughput sequencing; functional gene chip

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0200706）;Science and Technology Planning Project of Guangdong（2016A030313776，2017B020233002，2017B020203002）

0 引言

【研究意義】氮素是對作物生長發育及產量品質影響最大的必需礦質營養元素。近年來，盲目增施氮肥追求高產導致農田氮肥投入量過高而氮肥利用率偏低，不僅浪費了肥料資源，還帶來了一系列環境問題（時成俏等， 2011;楊小梅等， 2013;周晶等， 2016）。土壤氮循環與根際微生物密切相關，根際微生物是土壤和植物養分吸收、轉運的重要紐帶。肥料的施用不僅會影響土壤養分與作物生長，也會影響根際土壤微生物的群落結構組成（陳春蘭等，2011;彭衛福，2017;李明松，2018;馬鵬等，2020）。明確土壤氮轉化相關微生物菌屬及氮循環功能基因的強度，對促進土壤氮素轉化及提高氮肥利用率均具有重要意義。【前人研究進展】近年來，越來越多的報道表明長期施氮肥顯著影響與氮循環相關的微生物群落結構。Ai等（2013）、侯海軍等（2014）研究發現，長期施氮會影響氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌的群落結構，進而影響硝化作用，還會導致氨氧化菌群豐度的變化;當土壤中的氨分子濃度過高時，在酸性土壤中，氨氧化細菌的群落組成以Nitrosospira cluster 2為主。Zhao等（2014）研究發現，土壤中NH4+含量的提高會使Acidimicrobiia、Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria豐度提高，總氮含量的提高有利于Chloroflexi的生長繁殖。Jorquera（2014）等研究發現，長期施氮會影響固氮、硝化（氨氧化和亞硝酸鹽氧化）和反硝化過程的微生物菌群。周志成等（2015）通過構建氨單加氧酶基因（amoA）克隆文庫，發現長期施用氮肥能顯著降低湖南酸性紅壤中氨氧化古菌的豐度，并且氨氧化古菌在紅壤的硝化作用中占主導作用。Yu等（2016）研究表明，氨氧化細菌的相對豐度隨著施氮量的增加而逐漸升高。Zhong等（2016）研究發現，隨著施氮量的增加，氨氧化古細菌和氨氧化細菌數量下降，說明施氮量對氨氧化細菌群落結構的影響更強。彭衛福（2017）研究表明，高肥力土壤能提高土壤微生物活性和生化作用強度，施氮能增強氨氧化細菌及反硝化細菌的豐度。【本研究切入點】氮肥施用過量是農業生產中的突出問題，化肥減量增效仍是施肥調控措施的首要目標，以往關于氮素轉化的研究多集中在形態變化和理化性質對氮素循環的影響，近年來雖然有學者利用微生態分子生物技術如（16S rRNA、qPCR定量等技術）對于氮循環功能基因進行研究（儲成等，2019;李慧等， 2019），但基于功能基因芯片GeoChip技術研究甜玉米土壤氮循環功能基因亞類功能的報道甚少。【擬解決的關鍵問題】本研究采用大田區組試驗，利用16S rRNA高通量測序與功能基因芯片（GeoChip 5.0）技術，研究氮肥用量優化對甜玉米氮肥利用率及根際土壤氮循環微生物功能基因的影響，揭示甜玉米根際土壤細菌對不同氮肥用量水平的響應特征，探討氮循環亞類功能基因在細菌優勢屬中的分布以及驅動甜玉米根際土壤氮循環的強度，以期為農業生產中氮肥減施及高效利用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料及試驗地概況

供試甜玉米（Zea mays L.）品種為粵甜28號，由廣東省農業科學院作物研究所提供。

定位試驗于2018年春季開始在廣東省惠州市惠陽區農業技術推廣中心試驗基地（東經113°20′，北緯23°08′）進行，一年春秋兩季栽培。試驗區氣候類型為亞熱帶季風氣候，年均降水量800～1500 mm，年均氣溫13～22 ℃;土壤類型為赤紅壤，土壤理化性質：有機質21.89 g/kg、pH 5.1、堿解氮191.5 mg/kg、有效磷59.1 mg/kg、速效鉀224.1 mg/kg。

1. 2 試驗方法

廣東省甜玉米氮肥用量調研數據顯示，甜玉米常規施氮水平為420 kg/ha。通過測土配方和前期7個不同氮肥用量優化篩選試驗，本研究在磷、鉀肥用量優化一致的基礎上，設3個施氮水平：（1）對照，不施氮肥;（2）常規施氮水平，氮用量420 kg/ha;（3）優化施氮水平，氮用量330 kg/ha。每處理3次重復，隨機區組排列，共9個小區，小區面積為67.5 m2（4.5 m×15.0 m）。各處理磷肥用量150 kg/ha（以P2O5計），鉀肥用量225 kg/ha（以K2O計）。氮、磷、鉀肥品種分別為尿素（N 46%）、過磷酸鈣（P2O5 12%）和硫酸鉀（K2O 50%）。氮肥基施20%，苗期（10月10日）和拔節期（10月28日）分別追施30%和50%，磷肥作為基肥一次性施入土壤，鉀肥在基肥和拔節期各施入50%。甜玉米實行起壟種植，種植密度為45000 株/ha。其他田間管理同當地常規大田。試驗于2019年9月18日移苗，12月10日收獲。

1. 3 植株樣品采集及測定

收獲期選取各處理中10株長勢一致的植株整棵挖出，植株地上部分稱重、殺青（105 ℃下殺青30 min）、烘干（75 ℃烘干至恒重）、稱重和粉碎后測定地上部分全氮含量。甜玉米鮮苞產量采用全小區實收測產，并折算為公頃產量。植株樣品經H2SO4—H2O2消煮堿化后，采用凱氏定氮法測定植株全氮含量;甜玉米可溶性糖含量采用蒽酮法測定（魯如坤， 1999）。參照黃巧義等（2017）的方法計算以下參數：

地上部分吸氮量（kg/ha）=地上部分生物量×地上部分含氮量

氮肥偏生產力（kg/kg）=施氮區鮮苞產量/施氮量氮肥吸收利用率（%）=（施氮區地上部分吸氮量?對照區地上部分吸氮量）×100/施氮量

1. 4 土壤樣品采集及16S rRNA高通量測序

供試土壤樣品采集于2019年秋季甜玉米成熟期（12月10日），采用抖根法（Inderjit，1997）獲取甜玉米根際土壤放入無菌密封袋密封后用冰盒帶回實驗室于-80 ℃保存，用于16S rRNA高通量測序及基因芯片檢測。

采用土壤DNA提取試劑盒（MinkaGene Soil DNA Kit）對土壤樣品進行總DNA提取，利用NanoDrop One檢測DNA的完整性、純度和濃度。使用帶barcode的特異引物F515（5'-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3'）和R806（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌V4區域進行PCR擴增（Zhang et al.，2017）。PCR反應體系50 μL：2×PCR Mix 25 μL，20 ng/μL DNA模板3 μL，10 mmol/L正、反向引物各1 μL，ddH2O 20 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環;72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。將擴增產物用瓊脂糖凝膠回收、純化洗脫并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，長度在正常范圍（16S V4：290～310 bp）內。

建庫及測序：按照NEBNext? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs， USA）標準操作流程進行建庫，并委托廣東美格基因科技有限公司應用Illumina HiSeq 2500 平臺對構建的擴增子文庫進行上機測序。

1. 5 根際土壤微生物功能基因芯片分析

采用Cy3染料和DNA聚合酶I對純化后的DNA進行標記，采用QIAquiT1 PCR Purification Kit純化標記的DNA，置于Labconco Centrivap濃縮器中50 ℃干燥45 min，DNA稀釋至相同濃度后在95 ℃下孵育5 min，并在42 ℃下進行雜交16 h，將標記的DNA置于陣列上，然后在雜交站（BioMicro Systems， Inc.，Salt Lake City，UT）將陣列預熱至42 ℃（5 min），最后用NimbleGen MS200掃描儀進行預處理和信號強度的標準化。

1. 6 統計分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0進行統計分析，采用GraphPad Prism 8制圖，處理間的差異顯著性采用單因素方差分析進行LSD檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2. 1 不同氮肥用量對甜玉米產量、可溶性糖含量和氮效率的影響

由表1可知，與對照相比，常規施氮水平和優化施氮水平均能提高甜玉米鮮苞產量、可溶性糖含量及地上部分吸氮量，其中甜玉米鮮苞產量分別較對照顯著提高132.0%和123.7%（P<0.05，下同），但優化施氮水平與常規施氮水平間鮮苞產量無顯著差異（P>0.05，下同）。優化施氮水平的氮肥吸收利用率和偏生產力分別較常規施氮水平提高8.5%（絕對值）和7.7 kg/kg。

2. 2 不同氮肥用量對細菌群落結構的影響

3個處理9個土壤樣品的16S rRNA高通量測序共檢測到144736個OTUs，分屬于46門106綱213目289科404屬。本研究測序深度達到80%時，已基本覆蓋土壤樣品的絕大部分物種，繼續增加測序深度未發現更多新物種，說明測序結果可靠。前25個細菌屬水平群落結構組成分析結果如圖1所示，細菌群落菌屬豐度總體上表現為優化施氮水平>常規施氮水平>對照。ADurb.Bin063-1、Geobacter、Rhodanobacter、Mucilaginibacter、Pajaroellobacter、Bradyrhizobium、Bacillus和Conexibacter的相對豐度表現為優化施氮水平顯著高于常規施氮水平;Candidatus_Nitrosotales的相對豐度表現為對照>常規施氮水平>優化施氮水平;常規施氮水平的Candidatus_Nitrosotales和Candidatus_Nitrocosmicus菌屬相對豐度分別比優化施氮水平高0.6%和0.1%。Bryobacter和Gemma-timonas菌屬的豐度在優化施氮水平和常規施氮水平上無顯著差異。但優化施氮水平Bryobacter的相對豐度低于常規施氮水平。

2. 3 氮循環關鍵功能基因

采用GeoChip 5.0技術在9個土壤樣品中共發現2752個氮循環基因，分屬于8個亞類功能，分別具有固氮、氨化、硝化、反硝化、同化氮還原、氮同化、異化氮還原和氨氧化等作用。除氨氧化作用表現為常規施氮水平高于優化施氮水平外，其他7個氮循環亞類功能強度均表現為優化施氮水平高于常規施氮水平。優化施氮水平的固氮和異化氮還原作用與常規施氮水平差異不顯著;氨化、硝化、同化氮還原和氮同化作用均表現為優化施氮水平顯著高于常規施氮水平;反硝化作用相對強度表現為優化施氮水平>對照>常規施氮水平，但各處理間差異不顯著。

2. 4 亞類氮循環功能基因在細菌優勢屬中的分布及相關性

8個氮循環亞類功能在前25個細菌菌屬中的分布情況如表2所示，其中Geobacter和Bradyrhizobium具有固氮作用基因;Haliangium、Gemmatimonas、Mucilaginibacter、Bacillus和Bradyrhizobium具有氨化作用基因;Rhodanobacter、Gemmatimonas、Baci-llus和Bradyrhizobium具有反硝化作用基因;Sphingomonas和Bradyrhizobium具有同化氮還原作用基因，Anaerolinea、Geobacter、Bacillus和Bradyrhizobium具有異化氮還原作用基因。通過對細菌優勢屬與亞類氮循環功能基因的相關性進一步分析，結果（表3）表明，與氨化作用顯著相關的細菌菌屬為Mucilaginibacter和Bradyrhizobium。

結合細菌群落特征進一步分析表明，與氮循環密切相關的細菌菌屬Geobacter、Bradyrhizobium、Mucilaginibacter、Bacillus和Rhodanobacter的相對豐度表現為優化施氮水平顯著大于常規施氮水平;Sphingomonas的相對豐度表現為常規施氮水平>對照>優化施氮水平;Haliangium和Gemmatimonas 2個菌屬的相對豐度在優化施氮水平和常規施氮水平間無顯著差異。由此表明，優化施氮促進了氮循環的固氮、氨化、反硝化和異化氮還原作用，常規施氮水平促進了同化氮還原作用。

3 討論

3. 1 不同氮肥用量對甜玉米產量、可溶性糖含量和氮效率的影響

施氮量是影響甜玉米物質累積及產量形成的主導因素。陳建生等（2010）認為甜玉米的最佳經濟施氮量一般在370 kg/ha左右;程杏安等（2011）研究指出，甜玉米氮肥用量為300 kg/ha時既能保證葉面積和穗長等產量性狀得到有效提高，也不會導致氮肥過量引起氮營養過剩;趙福成等（2013）研究顯示，揚甜2號和超甜135甜玉米的鮮穗產量隨施氮量的增加先升高后降低，以施氮量為225 kg/ha時產量最高。合理的氮肥用量不僅能提高甜玉米鮮苞產量，還能提高甜玉米的可溶性糖含量，但過量施氮可能影響到正在發育籽粒的碳氮代謝，不利于產量形成和氮肥吸收利用率的提高（Osaki et al.，1995）。本研究中，優化施氮水平的可溶性糖含量、氮肥吸收利用率和偏生產力均高于常規施氮水平，且鮮苞產量與常規施氮水平無顯著差異，說明優化施氮水平在減氮90 kg/ha的基礎上，既能滿足甜玉米優質高產，又能提高氮肥吸收利用率，可作為推薦氮肥減施方案推廣應用。

3. 2 氮優化對甜玉米細菌群落結構的影響

土壤微生物參與土壤中多種物質的循環，對土壤氮循環起著重要作用。施用肥料在影響作物生長的同時，還能影響土壤微生物群落結構組成（張晶等，2009）。近年越來越多的報道表明，長期施氮肥顯著影響與氮循環相關的微生物群落結構。Jorquera（2014）等發現長期施氮影響包括固氮、硝化（氨氧化和亞硝酸鹽氧化）和反硝化過程的微生物菌群。Yu等（2016）、Zhong等（2016）等得出氨氧化細菌的相對豐度隨著施氮量的增加而逐漸升高。彭衛福（2017）研究表明，高肥力土壤能提高土壤微生物活性和生化作用強度，施氮能增強氨氧化細菌的豐度。Brussaard等（2007）、李明松（2018）研究表明，過量施氮會造成土壤酸化，不利于細菌群落的生長。本研究結果表明，氨氧化細菌Bryobacter的相對豐度表現為常規施氮水平高于優化施氮水平，與前人研究結果一致。周麗等（2017）的研究表明氮肥減量能增強土壤硝化作用，與本研究結果一致，優化施氮水平中硝化作用細菌Candidatus_Nitrocosmicus相對豐度低于常規施氮水平。硝化作用作為氮循環的關鍵過程，在氮循環中發揮重要作用，為反硝化作用提供一定的底物，因此在優化施肥處理中可能通過影響硝化作用進一步影響反硝化作用。

不同施氮水平可導致土壤中的優勢固氮菌群落結構不同（陳春蘭等，2011）。本研究發現，優化施氮水平的固氮菌屬Rhodanobacter和Bradyrhizobium的相對豐度顯著高于常規施氮水平。Coelho等（2008）研究表明，生物固氮過程需要消耗大量能量，在很大程度上依賴土壤中的有機碳含量，氮肥能顯著提高土壤有機碳，從而提高固氮菌屬的豐度。而周晶（2017）研究表明，固氮微生物的數量和種類與施入土壤的外源氮素密切相關，但施氮量過高也會抑制固氮微生物的生長。因此，適量施氮有助于協調氮循環各環節的菌屬豐度，從而形成良好的土壤氮循環，促進氮高效利用。

3. 3 氮優化對甜玉米根際土壤氮循環微生物功能基因的影響

微生物功能基因芯片主要獲取大量微生物群落參與生物化學過程的可靠性，尤其是微生物功能基因。本研究中3個處理共檢測出8個氮循環亞類功能，其中氨氧化作用表現為常規施氮水平高于優化施氮水平。與此對應的氨氧化細菌也有同樣的變化趨勢，與Yu等（2016）、彭衛福（2017）研究得出的施氮能增強氨氧化細菌豐度的結果一致。固氮作用表現為優化施氮水平高于常規施氮水平，也與優化施氮水平中固氮菌屬相對豐度高于常規施氮水平相一致。周晶（2017）關于長期施氮對東北黑土微生物及主要氮循環菌群影響的研究中也得出了相同結論，即合理施氮能在一定程度上增加固氮菌屬的豐度，從而增加菌屬固氮作用，施氮量過高會降低固氮基因的豐度。如Bradyrhizobium和Geobacter 2個固氮菌屬的相對豐度表現為對照<優化施氮水平>常規施氮水平。因此，施氮量能通過影響微生物群落結構及菌屬豐度來調節氮循環亞類功能。通過氮循環亞類功能在細菌優勢菌屬的分布和相關分析，得出氮循環亞類功能中的固氮、氨氧化、反硝化、同化氮還原和異化氮還原作用在前25個菌屬中有9個細菌菌屬分布，并且與氨化作用顯著相關的細菌菌屬有Mucilaginibacter和Bradyrhizobium。張晶等（2009）報道指出，Candidatus_Nitrocosmicus、Bryobacter和Pseudolabrys具有氮循環亞類功能。但本研究中氮循環亞類功能在這些細菌菌屬中并未體現分布，這主要是由于在基因芯片中功能基因對應的物種是以該基因最早發現的物種信息命名。

4 結論

氮肥用量優化有助于調控參與氮循環關鍵環節的細菌菌屬豐度，促進氮循環微生物功能基因的固氮作用和氨化作用，提高土壤氮肥吸收利用率和甜玉米可溶性糖含量，且甜玉米鮮苞產量與常規施氮水平相當，在氮肥減量增效的同時達到甜玉米穩產提質的效果，可作為推薦施肥方式進行推廣應用。

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（責任編輯 王 暉）