肺形側耳種質資源拮抗反應及RAPD分子標記遺傳多樣性分析

陳躬國　陳劍　吳漢瓊　劉新銳　方洪楓　駱志堅

摘要：【目的】分析肺形側耳種質資源拮抗反應和遺傳多樣性，為肺形側耳種質資源鑒定、合理利用和優良菌株遺傳選育等提供參考依據。【方法】分別通過拮抗反應和RAPD分子標記對41個肺形側耳菌株進行鑒定及遺傳多樣性分析，并對這2種方法的聚類分析結果進行比對及相關性分析。【結果】拮抗反應試驗結果顯示，僅有少數菌株與其他菌株間出現明顯拮抗反應，多數菌株間無拮抗反應或拮抗較弱，可能存在同種異名的現象。基于拮抗反應進行聚類分析，結果顯示在遺傳相似性系數0.65處，可將41個肺形側耳菌株分為五大類群，第I和III類群分別包括1個菌株，第II類群包括31個菌株，第Ⅳ類群包括4個菌株，第Ⅴ類群包括4個菌株，拮抗反應明顯的肺形側耳菌株聚在不同的類群，無拮抗反應或拮抗反應弱的菌株則聚在同一類群里。RAPD分析結果顯示，15條RAPD引物共擴增出117個位點，多態性位點有96個，多態性比例為82.1%;41個肺形側耳菌株遺傳相似系數為0.51～1.00，在遺傳相似系數0.84處可將41個肺形側耳菌株分為五大類群，其中，第Ⅰ類群包括3個菌株，第II類群包括4個菌株，第III類群包括6個菌株，第Ⅳ類群僅包括1個菌株，剩余的菌株屬于第Ⅴ類群，結合拮抗反應試驗結果發現有明顯拮抗反應的菌株聚在不同類群。拮抗反應和RAPD分析的聚類結果具有顯著相關性（r=0.674，t=5.95），表明拮抗反應和RAPD分子和標記在反映肺形側耳種質資源遺傳多樣性上具有較強的一致性，均能很好體現肺形側耳種質的遺傳關系?！窘Y論】肺形側耳菌株存在同種異名和同名異種現象。在實際生產中可選擇親緣關系較遠的材料作為親本菌株，以增加后代的遺傳變異，從而選育出綜合性狀優良的肺形側耳菌株。

關鍵詞： 肺形側耳;拮抗反應;RAPD;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號： S646.14? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-2892-09

Abstract：【Objective】The object of this study was to analyze the antagonistic reaction and genetic diversity of Pleurotus pulmonarius germplasms， and provide reference for the identification，reasonable utilization of germplasms and genetically breeding of P. pulmonarius strains. 【Method】Forty-one strains of P. pulmonarius were analyzed by antagonistic reaction and RAPD molecular markers on their identification and genetic diversity. And the cluster analysis results of the two methods were compared and correlated. 【Result】The results of the antagonistic reaction test showed that there were obvious antagonistic reactions among some strains of P. pulmonarius， but there were no antagonistic reactions or weak antagonistic reactions among most strains. Also， phenomenons of synonym possibly existed in the P. pulmonarius germplasms. Cluster analysis based on antagonistic reaction showed that 41 strains of P. pulmonarius could be clustered into five groups at the genetic similarity coefficient of 0.65. Group I and III included 1 strain respectively， group II included 31 strains， group IV included 4 strains， and group V included 4 strains. The strains with obvious antagonistic reaction were clustered in different groups， the strains with no antagonistic reaction or weak response or antagonism were clustered in the same group. A total of 117 sites were amplified by 15 RAPD primers， 96 of which were polymorphic， with a polymorphism rate of 82.1%. The genetic similarity coefficient of the 41 strains of P. pulmonarius ranged from 0.51 to 1.00， and cluster analysis showed that the tested strains could be divided into five groups at the level of genetic similarity 0.84. Group I included 3 strains， group II included 4 strains， group III included 6 strains， group Ⅳ included only 1 strain， and the remaining strains belonged to group Ⅴ. Strains with antagonistic reaction clustered in different groups in RAPD cluster analysis. The clustering results of antagonistic response and RAPD analysis were significantly correlated （r=0.674， t=5.95）， indicating that there was closely accordance between antagonistic reaction and RAPD molecular markers analysis， suggesting both analysis could well reflect the genetic relationship of P. pulmonarius germplasms. 【Conclusion】Phenomenon of different species with the same names and different names with the same species exist in P. pulmonarius. In actual production， germplasms with far genetic distance can be selected as parents to increase the genetic variation of the offspring， so as to breed the strains of P. pulmonarius with good comprehensive characters.

Key words： Pleurotus pulmonarius; antagonistic reaction; RAPD; genetic diversity; cluster analysis

Foundation item： National Edible Fungi Industry Technical System Funding Project（CARS-20）; Guiding Project of Fujian Science and Technology Department（2018N0035）; Regional Development Project of Fujian Science and Technology Department（2016N3018）; Science and Technology Project of Fuzhou （2016-N-106）

0 引言

【研究意義】肺形側耳[Pleurotus pulmonarius （Fr.） Quél.]商品名為秀珍菇，隸屬于擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）側耳科（Pleurota-ceae）側耳屬（Pleurotus），富含多種蛋白質、必需氨基酸、多糖、重要礦物質及維生素，營養價值高，還具有抗氧化活性、降低血糖及輔助腫瘤化療等藥理活性（Wahab et al.，2014;Xu et al.，2014;Abidin et al.，2016）。目前肺形側耳同種異名、同名異種現象較普遍（朱堅等，2007;忻雅等，2008），不僅影響實際生產中的菌種管理，還給種性鑒定、良種選育等科研及產業體系建立帶來巨大阻礙。因此，對肺形側耳種質資源進行鑒定和遺傳多樣性分析，有助于加強其菌種管理和新品種權保護，指導優良菌株選育中的親本選配，對促進整個產業的持續健康發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】擔子菌體細胞的非親和性（Samatic incompatibility，SI）是擔子菌在雙核菌絲階段發生的認識自我和排斥異己的過程，是保持群體遺傳多樣性的重要反映（Worrall，1997）。體細胞的非親和性往往導致菌絲體間出現明顯的分界線即拮抗反應，包括色素形成、致密的菌絲隆起、菌絲稀疏區域等，是體細胞非親和性的具體體現。拮抗反應是確定體細胞不親和性最簡便的方法，廣泛應用于食用菌菌株的初步鑒定和分類（賈定洪等，2013;王錦鋒等，2017）。李黎（2011）通過木耳栽培種質資源的拮抗反應分析其遺傳多樣性，結果表明木耳菌株間的拮抗程度與親緣關系呈正比，拮抗反應可有效地反映木耳種質的遺傳多樣性。譚偉等（2015）利用拮抗反應分析了通過種間雜交獲得的黃白側耳新菌株與親本之間的遺傳差異，證實了雜交菌株的真實性。RAPD分子標記已廣泛應用于種內和種間的親緣關系分析、個體鑒定、分類及差異表達基因篩選（Fonseca et al.，2008;溫志強等，2011;楊軍等，2016;張安世等，2018）。朱堅等（2007）通過RAPD分子標記對肺形側耳菌株進行綜合分析，結果發現菌株間遺傳差異小，且存在同名異種或同種異名的現象。葉長文等（2013）利用RAPD分子標記分析了香菇品種135與自然變異抗性新菌株慶元9015的基因片段差異，對差異基因片段進行克隆和測序，結果發現其與水解酶或信息素受體的部分氨基酸序列有較高的同源性，可能與香菇對溫度的敏感性有關。李紅等（2018）應用RAPD分子標記對35個金針菇菌株進行遺傳多樣性分析，結果顯示，該標記能將白色金針菇和黃色金針菇區分開來，與菌株農藝性狀分類結果一致，說明RAPD分子標記用于菌類遺傳多樣性分析是可行的。【本研究切入點】雖然李維煥等（2010）、馮偉林等（2014）對肺形側耳進行了遺傳多樣性分析，但供試材料較少，不夠全面。目前，基于拮抗反應試驗結果進行肺形側耳聚類分析，以及利用RAPD分子標記進行其遺傳多樣性分析的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】分別通過拮抗反應和RAPD分子標記對41個肺形側耳菌株進行鑒定及遺傳多樣性分析，并對這2種方法的聚類分析結果進行比對及相關性分析，為肺形側耳種質資源鑒定、合理利用和優良菌株遺傳育種等提供理論依據。

1 材料和方法

1. 1 試驗材料

供試材料為41個肺形側耳菌株，其來源如表1所示。PDA固體培養基、PD液體培養基、E.Z.N.A.? SP Plant DNA Kit購于Omega Bio-Tek公司。PCR隨機引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

1. 2 拮抗反應試驗

將供試菌株活化后，在同一PDA固體培養基上按“品”字形接種的3個不同肺形側耳菌株，置于25 ℃恒溫箱中暗光培養10～13 d，以自身拮抗為對照，根據NY/T 1845─2010《食用菌菌種區別性鑒定（拮抗反應）》判定標準，觀察不同菌株菌落間是否有菌絲隆起、有無色素沉淀、有無溝帶等方面的特征及這些特征的強弱來判斷肺形側耳菌株間拮抗反應的有無和強弱。

1. 3 基因組DNA提取

將供試菌株進行活化后接種于PD液體培養基中，25 ℃下150 r/min恒溫培養8 d。收集新鮮菌絲體經液氮研磨后，使用E.Z.N.A. ?Plant DNA Kit提取其基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測其提取效果，紫外分光光度計測定純度，-20 ℃保存備用。

1. 4 RAPD分析

試驗所用的PCR隨機引物為16個10堿基的寡核苷酸引物（表2）。反應體系25.0 ?L：10×PCR Buffer 2.5 ?L，25 mmol/L MgCl2 2.0 ?L，2.5 mmol/L dNTPs 1.4 ?L，5 U/?L Taq DNA聚合酶0.3 ?L，10 ?mol/L引物1.0 ?L，基因組DNA 模板0.4 ?L（約50 ng DNA），ddH2O補足至25.0 ?L。擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃ l min，36 ℃ l min，72 ℃ 90 s，共進行35個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在GelDoc-It凝膠成像系統拍照觀察。

1. 5 統計分析

觀察電泳圖譜并記錄所有位點的二元數據，即在同一遷移位置上有條帶賦值為“1”，無條帶賦值為“0”，形成0/1矩陣。使用NTSYS-pc 2.10e計算肺形側耳菌株間遺傳相似系數，采用非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析并構建肺形側耳菌株的系統發育進化樹。最后，用Mantel檢驗進行協表征矩陣和遺傳相似系數矩陣間的相關性分析，以檢測聚類結果的可靠性。

2 結果與分析

2. 1 拮抗反應檢測結果

拮抗反應試驗采用三點法對不同菌株兩兩組合進行對峙培養，來自不同遺傳背景的肺形側耳菌株菌絲的交匯區會形成分界線，除了個別菌株間的拮抗反應是隔離型外，大部分肺形側耳菌株的拮抗現象幾乎都是發生菌絲隆起的同時伴隨著色素沉淀，從平板背面看色素顏色從淡黃到深褐（圖1）。從菌絲隆起和色素沉淀的情況判斷菌株間拮抗反應的有無與強弱，結果如表3所示。P1（秀羅源）與P2（秀珍菇）、P6（秀76）、P7（秀臺1號）、P8（秀58）、P9（HC810）等17個菌株產生不明顯的拮抗線，但與P22（鳳尾菇）、P31（秀珍菇845）、P34（秀A）和P35（夏秀888）產生較明顯的拮抗線;P12（中農秀珍菇）、P19（秀珍菇77）和P31（秀珍菇845） 3個菌株間相互無拮抗，但與其他菌株有拮抗反應;P10（夏豐一號）、P26（夏秀66）、P30（秀珍菇3號）和P35（夏秀888）4個菌株間相互無拮抗線，與其他菌株均產生較明顯或不明顯拮抗線;P22（鳳尾菇）與其他菌株間均有不明顯或較明顯拮抗線，為獨立菌株;其他大部分菌株間未產生拮抗線或拮抗線不明顯。上述結果表明，僅有少數菌株與其他菌株間出現明顯拮抗反應，多數菌株間無拮抗反應或拮抗較弱，可能存在同種異名的現象。

以肺形側耳菌株間的拮抗反應強弱作為變量進行賦值。菌株間無拮抗反應（-），賦值為“0”，拮抗反應較弱不明顯（+），賦值為“1”，拮抗反應較明顯（++），賦值為“2”，拮抗反應明顯（+++），賦值為“3”，建立數據矩陣，采用UPGMA進行聚類分析。將聚類結果轉換為協表征矩陣，協表征矩陣和遺傳相似系數矩陣的相關系數（r）為0.99，表明聚類結果能很好地體現肺形側耳種質間的遺傳關系。由圖2可知，在遺傳相似性系數0.65處，可將41個肺形側耳菌株分為五大類群，除P1（秀羅源）和P40（臺秀122）分別單獨聚為第I類群和第III類群外，其余菌株聚為3個類群，其中，第II類群包括P8（秀58）、P17（秀63）、P24（鳳尾5號）、P29（日本秀珍菇）和P33（秀12）等31個肺形側耳菌株，菌株間的遺傳相似系數均為0.68;第Ⅳ類群包括P10（夏豐一號）、P26（夏秀66）、P30（秀珍菇3號）和P35（夏秀888）等4個肺形側耳菌株，菌株間的遺傳相似系數均為0.74;第Ⅴ類群包括P12（中農秀珍菇）、P19（秀珍菇77）、P22（鳳尾菇）和P31（秀珍菇845）等4個肺形側耳菌株，菌株間的遺傳相似系數為0.76。整體來看，拮抗反應明顯的肺形側耳菌株聚在不同的類群，無拮抗反應或拮抗反應弱的菌株則聚在同一類群里。

2. 2 肺形側耳菌株RAPD分析結果

用16個寡核苷酸引物對41個供試肺形側耳菌株的基因組DNA進行擴增，除引物S56擴增效果不理想外，其余15個引物擴增效果較好，共擴增出117個RAPD位點，各引物擴增的位點數為5～13個，平均每個引物擴增7.8個位點，其中多態性位點有96個，多態性比例為82.1%。引物S60和S85對肺形側耳菌株的電泳結果如圖3和圖4所示。

綜合這些引物擴增出的多態性位點，采用UPGMA對肺形側耳菌株進行聚類分析。將聚類結果轉換為協表征矩陣，協表征矩陣和遺傳相似系數矩陣的相關系數（r）為0.96，表明RAPD聚類結果能很好地體現肺形側耳菌株間的遺傳關系。41個肺形側耳菌株間遺傳相似系數為0.51～1.00，其中菌株P12（中農秀珍菇）與P33（秀12）的遺傳相似系數最小，為0.51，說明二者親緣關系最遠;菌株P4（秀迪1號）與P5（秀57）、P13（秀57-1）與P14（秀98）的遺傳相似系數最大，均為1.00，表明菌株間親緣關系很近，極有可能是同種異名。在遺傳相似系數0.60處，可將41個肺形側耳菌株分為兩大類群，菌株P12（中農秀珍菇）、P19（秀珍菇77）和P31（秀珍菇845）聚為一個類群，說明這3個菌株與其他菌株遺傳差異明顯，親緣關系較遠。在遺傳相似系數0.84處，可將41個肺形側耳菌株分為五大類群，即第Ⅰ類群包括P12（中農秀珍菇）、P19（秀珍菇77）和P31（秀珍菇845）等3個菌株;第II類群包括P10（夏豐一號）、P26（夏秀66）、P30（秀珍菇3號）和P35（夏秀888）等4個菌株;第III類群包括P33（秀12）、P34（秀A）、P36（秀珍菇163）、P39（秀珍16）、P40（臺秀122）和P41（農秀1號）等6個菌株;第Ⅳ類群僅包括P3（秀917）;剩余肺形側耳菌株屬于第Ⅴ類群（圖5）。結合拮抗反應試驗結果可知，有拮抗反應的菌株聚在不同類群。

2. 3 拮抗反應與RAPD分析的相關性分析結果

為了檢驗肺形側耳種質資源的拮抗反應和RAPD分析結果的相關程度，利用Mantel檢驗對基于拮抗反應聚類分析的遺傳相似系數矩陣和基于RAPD分析的遺傳相似系數矩陣進行相關性分析，結果表明，拮抗反應試驗和RAPD分析的結果具有顯著相關性（r=0.674，t=5.95），說明拮抗反應和RAPD分子標記在反映肺形側耳種質資源遺傳多樣性上有較強的一致性。

3 討論

體細胞的非親和性現象在子囊菌、擔子菌和半知菌等真菌中均有報道（Williams and Wilson，1966;Worrall，1997;Cortesi and Milgroom，1998），而拮抗反應是擔子菌的體細胞不親和性的一種表現形式（黃亦存，1996）。拮抗反應試驗是生理水平上鑒定不同菌株間遺傳差異的傳統方法，親緣關系較近的菌株間無拮抗或拮抗不明顯，若是親緣關系較遠，則菌株間有明顯的拮抗反應。本研究拮抗反應試驗發現，來自不同遺傳背景的肺形側耳菌株間出現隆起型拮抗線且在培養基平板背面有褐色色素沉淀，僅個別菌株間的拮抗反應是隔離型。試驗中還發現部分菌株間菌落形態不一致，但并無隆起型或隔離型拮抗線，平板背面也無色素沉淀，推測其為體細胞親和、親緣關系相近的不同菌株。拮抗反應作為菌株鑒定的傳統方法，雖然具有一定的局限性，但在識別同種異名、鑒定菌株之間的親緣關系和遺傳多樣性等方面仍為一種簡單有效的方法。通過拮抗反應結合分子標記的方法對菌株的親緣關系和遺傳多樣性進行綜合分析可得到更可靠的結果。本研究基于RAPD引物擴增出結果，采用UPGMA對肺形側耳菌株進行聚類分析，結果表明41個肺形側耳菌株間遺傳相似系數為0.51～1.00，大部分菌株間遺傳相似系數較高，說明菌株的親緣關系較近，少數菌株間遺傳相似系數為1.00，說明這些肺形側耳菌株極有可能為同種異名。究其原因可能和肺形側耳栽培品種主要引自我國臺灣地區有關，造成基因資源較狹窄。間接說明肺形側耳和其他食用菌一樣存在引種頻繁、穿插引種和部分菌株間存在同種異名等現象。

拮抗反應與分子標記分析結果相吻合在叢枝菌根（AM）真菌（Giovannetti et al.，2003）、木耳（李黎，2011）和靈芝等（潘麗晶等，2013）等中均有報道。但戚元成等（2010）將糙皮側耳的19個菌株間的拮抗線反應類型作為變量進行聚類分析，再與基于RAPD分子標記分析的聚類結果進行比較，結果發現這2種方法得到的聚類結果存在明顯差異，無相關性（r=0.115）。本研究利用Mantel檢驗對拮抗反應聚類分析的遺傳相似系數矩陣和RAPD標記聚類分析的遺傳相似系數矩陣進行相關性分析，結果發現，二者具有顯著相關性（r=0.674，t=5.95）;兩種方法的聚類結果均顯示，P12（中農秀珍菇）、P19（秀珍菇77）和P31（秀珍菇845）聚為一類，菌株P10（夏豐一號）、P26（夏秀66）、P30（秀珍菇3號）和P35（夏秀888）聚為一類，表明拮抗反應和RAPD標記在反映肺形側耳種質資源遺傳多樣性上具有較強的一致性。

4 結論

肺形側耳菌株存在同種異名和同名異種現象。在實際生產中可選擇親緣關系較遠的材料作為親本菌株，以增加后代的遺傳變異，從而選育出綜合性狀優良的肺形側耳菌株。

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（責任編輯 陳 燕）