一株抗辣椒瘡痂病菌生防菌株的鑒定及其生防機制初探

詹夢琳　陳長江　羅曉華　胡方平　蔡學清

摘要：【目的】篩選獲得對辣椒瘡痂病菌具有拮抗效果的內生細菌，并對其生防機制進行初步探究，為辣椒瘡痂病的生物防治提供菌株資源和理論依據。【方法】以課題組構建的內生細菌庫中的268株菌株為研究對象，采用抑菌圈法篩選獲得辣椒瘡痂病菌的拮抗菌株;通過生理生化特性測定、16S rDNA序列和gyrB基因序列分析明確拮抗菌株的分類地位;通過PCR擴增檢測拮抗菌株的脂肽類物質合成基因。【結果】從268株內生細菌中篩選獲得189株對辣椒瘡痂病菌具有不同拮抗效果的菌株，占篩選總菌株數的70.52%，其中菌株B10（3）對辣椒瘡痂病菌的抑菌效果最好，培養4 d時抑菌圈半徑為21.0 mm。綜合菌株B10（3）的生理生化特性測定、16S rDNA序列和gyrB基因序列系統發育鑒定結果，推斷該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliqufaciens）。菌株B10（3）的代謝產物對辣椒瘡痂病菌具有拮抗作用，且能擴增出8個脂肽類物質合成基因（ituC、yndG、srfAB、srfAA、yndJ、bmyB、bioA和fenD）的目的條帶。【結論】解淀粉芽孢桿菌菌株B10（3）對辣椒瘡痂病菌具有較好的拮抗效果，且具備合成脂肽類物質的能力，具有良好的應用前景。

關鍵詞： 辣椒瘡痂病菌;生防細菌;解淀粉芽孢桿菌;脂肽類合成基因

中圖分類號： S436.418.19;S476.19? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-2945-07

Abstract：【Objective】Screening out the antagonistic strains against Xanthomonas euvesicatoria，and their biological control mechanism were preliminarily explored， so as to provide strain resources for biological control against X. euvesicatoria. 【Method】There were 268 bacteria strains in endophytic bacteria library constructed by the research group. They were used to screen out the biocontrol bacterial strains against X. euvesicatoriaby inhibition zone method. And classification status of a biocontrol strain was determined by determination of physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA identification and gyrB gene sequence analysis， and PCR amplification was used to detect whether it contained lipopeptide synthesis gene. 【Result】A total of 189 strains were found to inhibit X. euvesicatoria with various levels of effects from 268 endophytic bacteria strains， accounted for 70.52 % of the total selected strains. The strain B10（3） had the best antagonistic effects， and the radius of bacteriostatic zone was 21.0 mm at 4 d of culture. Based on the physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequence and gyrB genes sequence analysis， the strain was identified as Bacillus amyloliqufaciens. The metabolites of this strain had antagonistic effect on X. euvesicatoria， and it could amplify 8 target bands of lipopeptide synthesis genes（ituC，yndG，srfAB，srfAA，yndJ，bmyB，bioA and fenD）. 【Conclusion】The strain B10（3） of B. amyloliqufaciens has good antagonistic effect on X.euvesicatoriawith the ability to synthesize lipopeptide，it has a good potential application prospect.

Key words： Xanthomonas euvesicatoria; biocontrol bacteria; Bacillus amyloliqufaciens; lipopeptide synthesis gene

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2017YFD0201106-02）; Science and Techno-logy Innovation Project of Fujian Agriculture and Forestry University（KFA17541A）

0 引言

【研究意義】由植物病原菌Xanthomonas euvesicatoria引起的辣椒瘡痂病（即辣椒細菌性斑點病）俗稱皰病、三落病，是世界范圍內普遍發生的一種辣椒病害，該病害不僅大幅降低辣椒的產量，且嚴重影響辣椒的果實品質，進而造成經濟損失（Jones et al.，2004;龍玲等，2009;陳新等，2011）。目前對該病害主要采用化學藥劑進行防治（楊子祥等，2014），但近年來由于化學防治帶來的農藥殘留、病菌抗藥性和環境污染等問題，使得科研工作者不斷地尋找更安全有效的防治途徑，而生物防治因具有安全、有效和無污染等優勢成為目前的研究熱點（楊海蓮等，2000;楊光偉等，2015）。因此，開展對辣椒瘡痂病菌拮抗細菌的篩選及其生防機制研究，對保障辣椒產業的可持續發展具有重要意義。【前人研究進展】對于茄科作物細菌性瘡痂病的生物防治已有一些研究報道，針對瘡痂病菌的生物防治方法主要有利用生防細菌（Byrne et al.，2004）、植物根際促生菌（Ji et al.，2005）、噬菌體（Iriarte et al.，2007）和病原hrp突變菌株（Moss et al.，2007）等。其中，關于生防細菌的研究報道，Byrne等（2004）利用丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）、惡臭假單胞菌（P. putida）和熒光假單胞菌（P. fluorescens）等對番茄瘡痂病進行溫室和大田防治試驗，結果顯示丁香假單胞菌Cit7在田間的防治效果最好，可將病害發生嚴重程度降低28.9%;El-Hendawy等（2005）利用水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）對番茄的種子、葉片、根系和土壤進行處理，發現該菌可降低番茄瘡痂病的發病程度，并對植株生長有一定促進作用;趙聰（2014）通過平板對峙試驗、離體生防試驗和溫室盆栽防病試驗，發現解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliqufaciens）Hy-7和Z2-13的脂肽類粗提物對辣椒瘡痂病菌具有明顯的抑制作用且具有良好生防效果;Chandrasekaran等（2019）通過維生素B6生物合成相關基因的表達譜分析和盆栽試驗發現，枯草芽孢桿菌（B. subtilis）CBR05可作為系統抗性誘導劑誘導番茄維生素B6的生物合成，進而提高番茄對瘡痂病菌的抗病性。國內關于篩選辣椒瘡痂病拮抗細菌及其機制研究的相關報道并不多見。【本研究切入點】辣椒瘡痂病是影響辣椒種植的重要病害之一，近年來由于化學防治帶來的病菌抗藥性及環境污染等問題，人們急需尋找新的替代方法，但目前有關辣椒瘡痂病拮抗菌的報道較少。【擬解決的關鍵問題】在本課題組構建的內生細菌庫基礎上，通過抑菌圈法篩選辣椒瘡痂病菌的拮抗生防細菌，繼而對具有較好抑菌效果的菌株進行常規和分子生物學鑒定，并探討其拮抗機制，旨在獲得對辣椒瘡痂病菌具有拮抗效果的生防菌株，為辣椒瘡痂病的生物防治提供菌株資源和理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 辣椒瘡痂病菌（X. euvesicatoria）及268株內生細菌菌株（包括解淀粉芽孢桿菌Hy-7）均由福建農林大學植物細菌實驗室分離和保存;枯草芽孢桿菌標準菌株BS168由福建農林大學植物細菌實驗室保存。

1. 1. 2 供試引物 16S rDNA基因通用引物，參照Lane（1991）;gyrB基因引物，參照Yamamoto和Harayama（1995）;脂肽類物質合成基因檢測引物，參照Joshi和McSpadden Gardener（2006）。具體見表1。

1. 2 生防菌株篩選

采用抑菌圈法（洪鵬翔等，2007）進行篩選。

1. 3 生防菌株鑒定

1. 3. 1 生理生化測定 以枯草芽孢桿菌標準菌株BS168為對照菌株，革蘭氏染色反應、運動性測定、硝酸還原反應、耐鹽性測定、丙二酸鹽和檸檬酸鹽利用測定、過氧化氫酶測定、淀粉水解酶測定、甲基紅試驗和吲哚試驗參照方中達（1998）的方法，V-P試驗參照東秀珠和蔡妙英（2001）方法，糖醇類物質利用測定參照Huang等（2012）的方法。

1. 3. 2 16S rDNA序列和gyrB基因序列分析 參照Lane（1991）的方法進行16S rDNA基因鑒定;參照Yamamoto和Harayama（1995）的方法進行gyrB基因分析。以供試菌株的總DNA為模板，分別用16S rDNA的通用引物和gyrB基因的特異性引物進行PCR擴增，在凝膠成像儀下觀察擴增結果，將條帶大小正確的PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，獲得的序列通過NCBI的BLAST檢索系統進行序列同源性分析。選取同源性最近的序列及相關的模式菌株序列，用MEGA 7.0進行比對分析，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建16S rDNA的系統發育進化樹，采用最大似然法（Maximum-likelihood，ML）構建gyrB基因的系統發育進化樹。

1. 4 生防菌株的生防機制測定

1. 4. 1 生防菌株代謝產物對辣椒瘡痂病菌的拮抗作用 采用牛津杯法（許英梅等，2018）進行測定。

1. 4. 2 脂肽類物質合成基因檢測 以解淀粉芽孢桿菌菌株Hy-7為陽性對照（楊瑞先等，2013），參照Joshi和McSpadden Gardener（2006）的方法，通過脂肽類物質合成基因的特異性引物進行PCR擴增。

2 結果與分析

2. 1 辣椒瘡痂病菌生防菌株篩選結果

2. 1. 1 生防菌株對辣椒瘡痂病菌的抑制作用 通過抑菌圈法篩選對辣椒瘡痂病菌具有拮抗作用的菌株，結果表明，從供試的268株細菌菌株中獲得189株對辣椒瘡痂病菌具有不同拮抗效果的菌株，占篩選總菌株數的70.52%，無拮抗效果的菌株79株，占篩選總菌株數的29.48%。其中抑菌圈半徑（r）≥20 mm的菌株14株，占篩選總菌株數的5.22%，抑菌圈半徑在5～20 mm的菌株138株，占篩選總菌株數的51.49%。

對抑菌圈半徑≥20 mm的14株菌株進一步復篩（生防細菌懸浮液OD600≈0.9，病原菌懸浮液OD600≈1.5），結果（表2和圖1）顯示，供試菌株的抑菌圈半徑隨著培養時間的延長而增大，當培養4 d時，菌株B10（3）的抑菌圈半徑最大，為21.0 mm。因此，選取菌株B10（3）進行鑒定并初步探討其生防機理。

2. 2 生防菌株鑒定結果

2. 2. 1 生理生化測定 由表3可知，菌株B10（3）為革蘭氏陽性菌，具有運動性，能利用海藻糖、麥芽糖、甜醇、山梨醇、甘露醇、丙三醇、丙二酸鹽和檸檬酸鹽，硝酸還原反應、淀粉水解酶測定、過氧化氫酶測定和V-P試驗為陽性，甲基紅試驗和吲哚試驗為陰性，耐鹽性7%。菌株B10（3）的生理生化測定結果除耐鹽性外均與對照菌株BS168一致，推測菌株B10（3）屬于芽孢桿菌屬。

2. 2. 2 16S rDNA序列和gyrB基因序列分析 對供試菌株B10（3）的16S rDNA基因和gyrB基因進行PCR擴增及序列測定分析，獲得供試菌株的16S rDNA基因和gyrB基因的核苷酸序列長度分別為1506和1206 bp，與目標條帶大小一致。將供試菌株的序列在NCBI數據庫上進行在線同源性比對分析，結果發現，供試菌株與解淀粉芽孢桿菌的相似性在99%以上。利用MEGA 7.0分別采用NJ法和ML法構建系統發育進化樹，結果（圖2和圖3）顯示，菌株B10（3）與芽孢桿菌屬的B. amyloliqufaciens聚成一支，推斷該菌株為解淀粉芽孢桿菌屬（B. amyloliqufaciens）。

2. 3 生防菌株脂肽類合成基因擴增結果

牛津杯法測定結果表明，生防菌株B10（3）的代謝產物對辣椒瘡痂病菌具有拮抗作用，接種后2 d，菌株B10（3）代謝產物的抑菌圈半徑約為5.0 mm。進一步通過脂肽類合成基因的特異性引物進行PCR擴增，檢測菌株B10（3）是否具備合成脂肽類物質的能力。以解淀粉芽孢桿菌菌株Hy-7為陽性對照，脂肽類合成基因ituC（575 bp）、yndG（372 bp）、srfAB（308 bp）、srfAA（273 bp）、yndJ（212 bp）、bmyB（395 bp）、bioA（210 bp）和fenD（293 bp）的特異性引物擴增結果（圖4）顯示，菌株B10（3）均可擴增到對應的基因片段，由此推斷該菌株具備合成脂肽類物質的能力。

3 討論

植物內生細菌具有穩定性高、生物作用時效性長、可作為外源基因載體等優點（楊海蓮等，2000;蔡學清等，2012），是一類具有巨大潛力的植物病害生防資源菌。近年的研究發現，植物內生細菌的種類主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）和假單胞桿菌屬（Pseudomonas）等（喻江等，2015），其中，芽孢桿菌屬的細菌具有生長繁殖速度快、耐熱性及抗逆性等優點，是一種相對理想的生防細菌（朱玥妍等，2012）。本研究篩選獲得的植物內生生防細菌B10（3）為解淀粉芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌是目前作為生防芽孢桿菌進行研究和開發的主要菌種之一，具有廣闊的應用前景。

已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌對柑橘潰瘍病、西瓜細菌性果斑病、辣椒瘡痂病、花生白絹病和黃瓜枯萎病等多種植物病害均具有良好的防治效果（孫燕霞等，2010;趙聰，2014; 陸燕等，2016 ），其主要抑菌活性物質有抑菌蛋白、脂肽類物質和聚酮化合物等（吳一晶等，2012），其中脂肽類抗生素包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和豐原素（Fengycin）等（Koumoutsi et al.，2004）。Grady等（2019）研究發現解淀粉芽孢桿菌9D-6產生的表面活性素、Medeot等（2019）研究發現解淀粉芽孢桿菌MEP218產生的豐原素均對瘡痂病菌具有明顯的抑制作用，但Hossain等（2015）研究發現srfAA基因控制合成的表面活性素并不是解淀粉芽孢桿菌菌株AP193起拮抗作用的脂肽類物質，說明并非所有種類的脂肽類物質均具有良好的拮抗效果。本研究通過牛津杯法證明菌株B10（3）的代謝產物對辣椒瘡痂病菌具有拮抗作用，且可擴增獲得8種脂肽類物質合成基因的特異性條帶，其中包括控制合成表面活性素、伊枯草菌素和豐原素等的相關基因，表明該菌株可能通過合成脂肽類物質抑制辣椒瘡痂病菌的生長，但具體是哪類物質、或是其中一種或幾種物質協同作用，需進一步探究。

目前對辣椒瘡痂病具有較好防效的解淀粉芽孢桿菌菌株報道依舊很少，篩選以獲得對辣椒瘡痂病具有防效的生防細菌是實現該病害生物防治的前提。本研究篩選獲得的菌株B10（3）具有較好的抑菌作用，有望為辣椒瘡痂病的生物防治提供菌種資源，但有研究表明，室內平板的拮抗作用與田間的防效并非都成正相關（Nagendra et al.，2019），因而本研究獲得的菌株B10（3）對于辣椒瘡痂病的溫室及大田防治效果尚需進一步驗證。

4 結論

本研究在課題組構建的植物內生細菌庫中通過抑菌圈法篩選獲得1株對辣椒瘡痂病菌具有拮抗效果的生防菌株B10（3），通過革蘭氏染色、生理生化測定和分子生物學方法將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌，該菌株可擴增到8個脂肽類物質合成基因目的條帶，具備合成脂肽類物質的能力，具有良好的應用前景。

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（責任編輯 麻小燕）