變異豬流行性腹瀉病毒M和N雙基因融合真核表達及其活性鑒定

王隆柏　陳秋勇　吳學敏　陳如敬　車勇良　周倫江

摘要：【目的】體外表達變異豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的M-N雙基因融合蛋白并明確其生物活性，為開展PEDV新型疫苗及其診斷技術研究提供更多的候選蛋白。【方法】將變異PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2（pM2）真核表達載體構建pM2-M真核質粒，通過同源重組將N基因克隆至M2-M基因片段構建pM2-M-N雙基因融合重組質粒，然后轉染293T細胞表達出M-N雙基因融合蛋白。通過Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠試驗鑒定表達融合蛋白的生物學活性。【結果】擴增獲得的M基因、N基因片段大小分別為678和1359 bp，且與原序列的相似性均達100.0%。將M基因和N基因并連接至pM2真核表達載體成功構建獲得pM2-M-N雙基因融合重組質粒，M-N雙基因片段大小為2004 bp，且與原序列的相似性為99.3%。以pM2-M-N雙基因融合重組質粒轉染239T細胞，表達出大小約75 kD且具有免疫活性的M-N雙基因融合蛋白，純化的M-N雙基因融合蛋白能與PEDV陽性血清反應，與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等病毒均無交叉反應;以其免疫BLAB/c小鼠能誘導產生特異性抗體。【結論】通過pM2真核表達載體能構建獲得變異PEDV毒株的pM2-M-N融合雙基因重組質粒，轉染293T細胞后可表達出具有良好免疫活性的M-N雙基因融合蛋白，為后期開展變異PEDV基因工程疫苗及其診斷技術研究提供更多的候選蛋白。

關鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）;M基因;N基因;雙基因;融合蛋白

中國分類號： S852.43? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-3083-07

Abstract：【Objective】The protein of M-N double gene fusion protein plasmid of variant porcine epidemic diarrhea virus（PEDV） was expressed in vitro，and clarified the immunological activity of the protein，more candidate fusion proteins were provided to carry out research on new vaccines and diagnostic technologies for PEDV. 【Method】The M gene of variant PEDV was cloned into pEASY-Blunt M2（pM2） eukaryotic expression vector and pM2-M eukaryotic plasmid was built， then N gene was cloned into M2-M gene fragment to construct pM2-M-N double gene fusion? recombinant plasmid? by homologous recombination， and transformed into 293T cell， M-N double gene fusion protein was expressed accordingly. Biological activity of expressing fusion protein was tested by Western blotting， ELISA and immunity BLAB/c mice test. 【Result】The amplified fragments of M gene and N gene were 678 and 1359 bp respectively， and the similarities compared with the original sequence were both 100.0%. The M gene and N gene were linked into pM2 eukaryotic expression vector， and pM2-M-N double gene fusion recombinant plasmid was built. The amplified fragments of M-N double fusion genes was 2004 bp， and the similarity was compared with the original sequence was 99.3%. pM2-M-N double gene fusion recombinant plasmid transfected 239T cells， and M-N double gene fusion protein（about 75 kD） with immunological competence. The purified M-N double gene fusion protein could react with PEDV positive serum. The fusion protein had no crossreactions with porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）， pseudorabies virus（PRV）， porcine circovirus type 2（PCV2）， classical swine fever virus（CSFV） and porcine transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. The BLAB/c mice immunized by it could produce specific antibody. 【Conclusion】The pM2-M-N fusion double gene recombinant plasmid of variant PEDV can be constructed by pM2 eukaryotic expression vector， the M-N double fusion protein with immunological competence is expressed after 293T cell being transfected. More candidate fusion proteins are provided to carry out genetic engineering vaccines and diagnostic techniques for variant PEDV.

Key words： porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）; M gene; N gene; double genes; fusion protein

Foundation item： Basic Research Project of Fujian Public Welfare Research Institutes（2018R1023-4）; Fujian Mo-dern Agricultural Pig Industry Technology System Construction Project（Minnongzong〔2019〕144）

0 引言

【研究意義】豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，以發病豬嘔吐、腹瀉、脫水及發病哺乳仔豬高致死率為特征的腸道傳染病（Chang et al.，2002;楊曉宇等，2018）。PED最早于1978年在英國報道，隨后蔓延至歐洲，我國于1980年首次報道。由于商品化疫苗的廣泛使用，該病在一定程度上得到有效控制。但至2010年底，因PEDV變異，原有商品化疫苗對豬群的保護效果不佳，從而致使PED在我國再次大規模暴發流行;且2013年在墨西哥、美國及加拿大等歐美養豬國家也相繼再次暴發流行（Huang et al.，2013;Pasick et al，2014;Sun et al.，2016）。因此，開展PEDV變異研究，尤其對變異的結構蛋白M和N雙基因進行融合表達，可為進一步研究變異PEDV新型基因工程疫苗及其診斷技術提供候選蛋白。【前人研究進展】PEDV隸屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus），其病毒核酸為正義單鏈RNA，PEDV基因組全長約28 kb（Vlasova et al.，2014），主要結構蛋白有膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）、小膜蛋白（E）和突糖蛋白（S）（Brian and Baric，2005）。M蛋白是PEDV重要的結構蛋白，在病毒粒子組裝及出芽過程中發揮重要作用，能刺激機體產生免疫保護抗體，并介導機體產生α干擾素，可作為新疫苗的候選抗原（Gao et al.，2007）。N蛋白在病毒結構中屬于較大的蛋白，在感染宿主細胞內能大量表達，豬群在感染早期即能檢測到較高水平的N蛋白抗體（Li et al.，2009;祁光宇等，2018）;此外，N蛋白是病毒主要的免疫原蛋白之一，可刺激機體產生有效的免疫應答，抑制細胞產生干擾素，還能誘導輔助特異性體液免疫的Th細胞增殖（Vlasova et al.，2014）。S蛋白具有B淋巴細胞抗原決定簇和宿主細胞氨肽酶受體（PAPN）的識別位點，對病毒的吸附、融合及侵入宿主細胞等過程起重要作用，且在感染宿主體內介導中和抗體產生（Mariela and Laude，1994;Yeo et al.，2003）。E蛋白決定病毒的形狀，參與病毒包膜形成和出芽過程，還能誘導細胞凋亡。雖然M基因和N基因相對較保守，但2010年底發現的PEDV變異毒株與經典CV777毒株及早些年份分離獲得的毒株相比較，其氨基酸序列已發生變異，在構建的遺傳進化樹上也處于不同分支（王隆柏等，2014;胡凌等，2015;宋聰等，2016）。至今，已有利用PEDV單個基因片段成功建立ELISA抗體檢測方法，并研制出基因工程口服疫苗。姜艷平等（2008）研究表明，以原核表達的重組N蛋白作為檢測抗原在監測PEDV感染及評價疫苗免疫效果方面具有較高的應用價值，是代替全病毒作為檢測抗原的良好選擇。向敏等（2013）將編碼PEDV部分S蛋白的保護性抗原基因（COE）插入載真核表達載體pIRES2-EGFP成功構建獲得COE核酸疫苗。朱衛霞等（2014）應用原核表達系統成功實現PEDV的N蛋白可溶性表達，并證實該蛋白具有良好的完全抗原活性。姚作俊等（2017）基于S1蛋白成功建立了檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。朱文姣等（2018）將COE基因克隆至原核表達載體pET-32a（+）構建重組表達質粒pET-32a-COE，經IPTG誘導表達獲得的融合蛋白能與抗PEDV的陽性血清發生特異性結合，即具有良好的免疫原性，作為免疫抗原制備的卵黃抗體具有較高抗體效價。【本研究切入點】M基因和N基因是PEDV疫苗研制及其診斷技術重要基因，但至今鮮見基于同源重組原理通過真核表達載體表達出PEDV M-N雙基因融合蛋白的研究報道。【擬解決的關鍵問題】基于同源重組原理，以PEDV變異毒株為研究對象、pEASY-Blunt M2（pM2）為真核表達載體，利用無縫拼接技術構建M和N的雙基因質粒并在體外表達出M-N雙基因融合蛋白，明確M-N雙基因融合蛋白的生物活性，為開展PEDV新型疫苗及其診斷技術研究提供更多的候選蛋白，也為今后開展其他融合蛋白的研究提供技術借鑒。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

RNA提取試劑盒、pM2真核表達載體、FastPfu Fly DNA聚合酶、pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit、dNTPs、TransStart? KD Plus DNA聚合酶、Trans1-T1感受態細胞及EQKLISEEDL融合蛋白純化試劑盒等購自北京全式金生物技術有限公司;10%分離膠和轉印膜購自上海碧云天生物技術有限公司;羊抗鼠/羊抗兔HRP酶購自武漢博士德生物工程有限公司;BLAB/c小鼠購自福州吳氏實驗動物貿易有限公司;PEDV陰性血清購自BioNote公司;變異PEDV-FJFQ2014毒株和兔抗高免血清由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所保存提供。

1. 2 試驗方法

2 結果與分析

2. 1 M基因和N基因PCR擴增結果

以cDNA為模板，分別進行M基因和N基因PCR擴增，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果（圖1）顯示，擴增獲得的M基因、N基因片段大小約為700和1400 bp，與預期結果相符。經測序得知，擴增獲得的M基因、N基因片段大小分別為678和1359 bp，且與原序列的相似性均達100.0%。

2. 2 pM2-M真核質粒PCR鑒定結果

將M基因與pM2真核表達載體進行連接，轉化Trans1-T1感受態細胞，通過PCR鑒定M2-M陽性單克隆，結果獲得約6100 bp的片段（圖2），與預期結果相符。經測序得知，擴增獲得的M2-M基因片段大小為6104 bp，且與原序列的相似性為99.4%。

2. 3 pM2-M-N雙基因融合重組質粒PCR鑒定結果

將擴增獲得的M2-M基因片段與N基因片段進行無縫拼接，然后全部轉化Trans1-T1感受態細胞，通過PCR鑒定M-N陽性單克隆，結果獲得約2000 bp的基因片段（圖3），與預期結果相符。經測序得知，M-N雙基因片段大小為2004 bp，且與原序列的相似性為99.3%。

2. 4 融合蛋白SDS-PAGE電泳分析結果

在pM2-M-N重組質粒轉染的293T細胞中，使用10%分離膠進行SDS-PAGE電泳分析，結果顯示約在75 kD處檢測到對應的目的蛋白條帶（圖4），而在pM2真核表達載體轉染的293T細胞中未檢測到對應的目的蛋白條帶。

2. 5 融合蛋白純化結果

按EQKLISEEDL融合蛋白純化試劑盒說明對原核表達的M-N雙基因融合蛋白進行純化，其SDS-PAGE電泳分析結果表明，純化的M-N雙基因融合蛋白大小約75 kD（圖5），與預期結果相符。

2. 6 融合蛋白表達的Western blotting鑒定結果

Western blotting鑒定結果表明，pM2-M-N重組質粒轉染293T細胞的總蛋白能與變異PEDV兔抗高免血清反應，獲得約75 kD的目的蛋白條帶（圖6），而pM2真核表達載體轉染293T細胞及未轉染293T細胞的總蛋白檢測結果均呈陰性，進一步說明以pM2-M-N重組質粒轉染293T細胞能表達獲得M-N雙基因融合蛋白，且具有免疫活性。

2. 7 融合蛋白免疫活性的ELISA檢測結果

ELISA檢測結果（圖7）表明，純化的M-N雙基因融合蛋白與PRRSV陽性血清、PRV陽性血清、CSFV陽性血清、PCV2陽性血清及TGEV陽性血清的OD490均小于PEDV陰性血清的OD490，呈陰性，未發生交叉反應;而與PEDV陽性血清的OD490為1.354，說明純化的M-N雙基因融合蛋白能與PEDV陽性血清反應，即具有免疫活性。

2. 8 融合蛋白免疫小鼠的抗體檢測結果

以純化的M-N雙基因融合蛋白免疫小鼠后未出現異常臨床癥狀。由圖8可看出，二次免疫第1 d在小鼠血清中已能檢測到特異性抗體，隨后小鼠血清抗體水平逐漸升高，至二次免疫第28 d其血清抗體水平達最高值，OD490為1.771;而陰性對照小鼠血清未檢測到相應的抗體，表明注射純化的M-N雙基因融合蛋白能誘導小鼠產生特異性抗體。

3 討論

鑒于基因組學技術的快速發展，有目的地將兩段或多段編碼功能蛋白的基因首尾拼接在一起，由同一調控序列控制構成的基因表達后所獲得的蛋白產物稱為融合蛋白。當前，融合蛋白在雙功能酶（多功能酶）、定向藥物、溶栓劑及抗菌肽等方面已得到廣泛應用。郭建強等（2009）利用pStar、pShuttle-CMV和pGEM-T Easy Vector等3個載體，成功構建出Ad-M1-HA重組腺病毒載體，并在293T細胞中表達出具有免疫原性的融合蛋白。黃小波等（2012）利用pVAX載體構建了TGEV的pVAX-S-N真核重組質粒，以其免疫小鼠也能產生特異性抗體，為TGEV基因工程疫苗研究打下了基礎。鑒于M蛋白和N蛋白在PEDV復制及產生免疫功能過程中發揮的重要作用，且至今未見表達變異PEDV毒株M-N雙基因融合蛋白的相關研究報道。因此，開展M-N雙基因融合蛋白研究可為開展PEDV新型疫苗及其診斷技術研究提供更多的候選蛋白，同時為開展其他融合蛋白的研究提供技術借鑒。

有關PEDV結構蛋白表達的研究，姜艷平等（2008）、向敏等（2013）、朱衛霞等（2014）、姚作俊等（2017）已成功表達出單個N蛋白和截斷的S蛋白，并建立了針對N蛋白或S蛋白的ELISA抗體檢測方法。王隆柏等（2018）利用pE2原核表達載體在Transetta（DE3）感受態細胞中表達出PEDV的M-N融合雙基因蛋白，并證實其具有免疫活性，但該融合蛋白主要以包涵體形式表達，因此溶解純化相對較困難。本研究選用pM2真核表達載體，利用同源重組和無縫拼接技術，將PEDV的M基因和N基因進行融合，通過增強型CMV啟動子高效表達目的基因，轉化Trans 1-T1感受態細胞，構建pM2-M-N重組質粒并轉染至293T細胞表達出M-N雙基因融合蛋白，結果發現在293T細胞及其培養上清液中均能檢測到M-N雙基因融合蛋白，易于收集和純化，且具有免疫活性。

本研究結果表明，以pM2-M-N雙基因融合重組質粒轉染293T細胞表達獲得的M-N雙基因融合蛋白具有良好免疫活性，且能誘導BLAB/c小鼠產生相應的特異性免疫抗體。通過真核系統表達獲得的蛋白，較利用原核載體表達出的蛋白具有天然活性，更適用于免疫功能研究。可見，M-N雙基因融合蛋白的成功表達為后期開展變異PEDV基因工程疫苗及其診斷技術研究提供更多的候選蛋白。此外，在基因連接和載體構建方面，pM2真核表達載體兩端偶聯有拓撲異構酶，此酶具有限制性內切酶和連接酶的功能，構建重組質粒時只需將真核表達載體與特異性基因片段在25 ℃下孵育5～10 min即可獲得連接產物，與常規真核表達方法相比，具有反應時間短、操作簡單的特點，為其他病毒直接融合相鄰雙基因載體的構建提供了技術借鑒。

4 結論

通過pM2真核表達載體能構建獲得變異PEDV毒株的pM2-M-N融合雙基因重組質粒，轉染293T細胞后可表達出具有良好免疫活性的M-N雙基因融合蛋白，為后期開展變異PEDV基因工程疫苗及其診斷技術研究提供更多的候選蛋白。

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（責任編輯 蘭宗寶）