豬源IKKγ在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其多克隆抗體制備

趙祥秀　黃茂發(fā)　高躍美　唐榕澤　胡仁俊　梁晶晶　李曉寧　羅廷榮

摘要：【目的】制備豬源IKKγ多克隆抗體，為進(jìn)一步研究IKKγ蛋白生物學(xué)特性及揭示IKKγ蛋白與豬瘟病毒（CSFV）間相互作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。【方法】利用RT-PCR從豬腎細(xì)胞（PK-15）中克隆原核表達(dá)的IKKγ基因功能片段（561 bp），與原核表達(dá)載體pET-32a（+）構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pET-IKKγ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)純化和濃縮后，免疫小鼠制備豬源IKKγ多克隆抗體。同時(shí)克隆IKKγ基因全長(zhǎng)序列（1356 bp），與真核表達(dá)載體pCMV-HA構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和PK-15細(xì)胞，檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況。【結(jié)果】以原核重組質(zhì)粒pET-IKKγ轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能表達(dá)出約40 kD的融合蛋白，且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式進(jìn)行表達(dá)，可通過Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化，已獲得較高純度的融合蛋白IKKγ。構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ能在293T細(xì)胞中成功表達(dá)出IKKγ蛋白;制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體能與293T細(xì)胞表達(dá)融合蛋白IKKγ發(fā)生特異性反應(yīng)，其抗體效價(jià)為1∶16000，與PK-15細(xì)胞表達(dá)IKKγ蛋白也具有良好的反應(yīng)性，其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表達(dá)高峰期。此外，制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體能在PK-15細(xì)胞中成功檢測(cè)到IKKγ蛋白，說明豬源IKKγ多克隆抗體與真核細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的IKKγ蛋白特異性良好。【結(jié)論】制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體具有效價(jià)高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于檢測(cè)CSFV感染PK-15細(xì)胞中IKKγ蛋白表達(dá)水平，為下一步研究IKKγ蛋白生物學(xué)特性及揭示NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能機(jī)制提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： IKKγ;豬瘟病毒（CSFV）;原核表達(dá);真核表達(dá);多克隆抗體

中圖分類號(hào)： S852.43? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）12-3099-10

Abstract：【Objective】The preparation of polyclonal antibody against IKKγ from pigs would lay a foundation for further study on the biological characteristics of IKKγ protein and reveal the interaction mechanism between IKKγ protein and classical swine fever virus（CSFV）. 【Method】The functional fragment of IKKγ gene（561 bp） was cloned from porcine kidney cells（PK-15） by RT-PCR. The recombinant plasmid pET-IKKγ was constructed with the prokaryotic expression vector pET-32a（+）. The recombinant plasmid pET-IKKγ was transformed into Escherichia coli BL21（DE3） competent cells and expressed by IPTG induction. The expressed fusion protein was purified and concentrated， and then the polyclonal antibody of pig IKKγ was prepared by immunizing mice. At the same time， the full-length sequence of IKKγ gene（1356 bp） was cloned and the eukaryotic expression vector pCMV-HA was used to construct the eukaryotic recombinant plasmid pCMV-HA-IKKγ， which was transfected into 293T cells and PK-15 cells respectively to detect the expre-ssion of the fusion protein. 【Result】The prokaryotic recombinant plasmid pET-IKKγ was transformed into BL21 competent cells， and about 40 kD fusion protein was expressed after IPTG induction. The fusion protein was mainly expressed in the form of soluble protein， which could be purified by Ni-NTA affinity chromatography. High-purity fusion protein IKKγ was obtained. The recombinant plasmid pCMV-HA-IKKγ could successfully express IKKγ protein in 293T cells; the polyclonal antibody against porcine IKKγ could specifically react with the fusion protein IKKγ expressed in 293T cells， and the titer of the antibody was 1∶16000， which also had good reactivity with the IKKγ protein expressed in PK-15 cells. The peak of IKKγ protein expression was 36 h after CSFV infection. In addition， IKKγ protein was successfully detected in PK-15 cells by the polyclonal antibody against porcine IKKγ， which indicated that the polyclonal antibody against porcine IKKγ had good specificity with the IKKγ protein expressed in eukaryotic cells. 【Conclusion】The polyclonal antibody against IKKγ from pig has the characteristics of high titer and high specificity. It can be used to detect the expression level of IKKγ protein in PK-15 cells infected with CSFV， and provide technical support for further study on the biological cha-racteristics of IKKγ protein， the interaction between CSFV proteins and revealing the transcriptional regulation mechanism of NF-κB signaling pathway.

Key words： IKKγ; classical swine fever virus（CSFV）; prokaryotic expression; eukaryotic expression; polyclonal antibody

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660722）; National Key Research and Development Program of China （2018YFD0500104）; Guangxi Natural Science Foundation （2017GXNSFAA198137）

0 引言

【研究意義】IκB（Inhibitor of NF-κB）家族包括IκBα、IκBβ和IκBγ等3個(gè)成員，IκB蛋白包含一系列的錨蛋白重復(fù)序列，可與NF-κB結(jié)合;且在正常狀態(tài)下，NF-κB與IκB結(jié)合的復(fù)合體存在于細(xì)胞質(zhì)中，處于未激活狀態(tài)（Isra?l，2000）。IκB激酶家族（Inhibitor of NF-κB kinases，IKKs）作為核因子Kappa B信號(hào)途徑的關(guān)鍵成員，能解除IκB對(duì)NF-κB的抑制作用，激活參與應(yīng)激反應(yīng)、免疫細(xì)胞的增殖分化與凋亡及腫瘤形成等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控（Péant et al.，2011;艾尼瓦爾·艾木都拉，2020）。IKK激酶復(fù)合體主要由2個(gè)高度同源的激酶亞基（IKKα/IKK1和IKKβ/IKK2）及1個(gè)調(diào)節(jié)亞基NEMO（NF-κB essential modulator）/IKKγ構(gòu)成（Longa et al.，1989）。其中，IKKα和IKKβ在序列上有52%的相似性，且在催化基序內(nèi)相似性可達(dá)65%;而IKKγ與IKKa和IKKβ無(wú)相似性（Ben-Neriah and Karin，2011）。IKKγ可形成穩(wěn)定的二聚體，并與IKKs復(fù)合物的其他亞基相結(jié)合。IKKγ二聚體的形成及其與IKKs催化亞基的結(jié)合對(duì)NF-κB活化起關(guān)鍵作用（Li et al.，2011;Zaghloul et al.，2012），是研究病毒蛋白功能及病毒與宿主相互作用機(jī)理的理想輔助工具。因此，克隆豬源IKKγ基因并制備豬源IKKγ抗體，對(duì)揭示IKKγ蛋白生物學(xué)特性及NF-κB信號(hào)通路激活原理具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控細(xì)胞因子、化學(xué)激活素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞黏附分子及其他免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)（康喜龍，2018）。作為調(diào)節(jié)亞基，IKKγ在NF-κB途徑中被視為一種支架蛋白，能與多種分子相互作用。在脊椎動(dòng)物中，NF-κB是調(diào)控各種刺激引起細(xì)胞凋亡反應(yīng)的關(guān)鍵因素，是控制抗凋亡基因和促凋亡基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一（Kankaya et al.，2015）。IKKγ在IKK復(fù)合體中扮演著橋聯(lián)IKKa和IKKβ與其上游激酶的作用（Li et al.，2003），當(dāng)細(xì)胞因子（Cytokine）或病原體相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）刺激細(xì)胞表面的信號(hào)受體，如Toll樣受體4（Toll 1ike receptor 4，TLR4）或腫瘤壞死因子受體1（Tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1），即發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活I(lǐng)KK復(fù)合體。至今，雖然IKK激酶活化前的級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制尚未明確，但與其他激酶類似，IKK激酶活化也需要磷酸化2個(gè)絲氨酸殘基（IKKβ- Ser177和181;IKKα-Ser176和180）（Mercurio et al.，1997;Delhase，1999）。在IKK復(fù)合體作用下，IκB的第32位和第36位絲氨酸迅速被磷酸化，通過泛素化途徑降解，NF-κB二聚體被釋放出來(lái)，并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄（Tergaonkar et al.，2005;Baker et al.，2011）。IKK激酶屬于大型的多蛋白復(fù)合物，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，且涉及多種生物學(xué)過程，包括先天免疫、炎癥及生長(zhǎng)發(fā)育等（Priyathilaka et al.，2020）。已有研究表明，marc-145細(xì)胞感染藍(lán)耳病病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）后，IKKγ基因及其蛋白水平均上調(diào)，進(jìn)一步說明NF-κB信號(hào)通路被激活，IKKγ基因參與抗PRRSV免疫（段馬魁等，2018）。IKKγ與IKKα和IKKβ結(jié)合，以維持IKK激酶復(fù)合體的空間構(gòu)型，且IKKγ在IKK激酶復(fù)合體的活化過程中發(fā)揮信息傳遞作用（Yamaoka et al.，1998），因此IKKγ是研究NF-κB機(jī)制的重要靶標(biāo)（Song et al.，2005）。【本研究切入點(diǎn)】目前，針對(duì)人類及鼠等生物的IKKγ已得到深入研究，有關(guān)于豬IKKγ的研究則相對(duì)較少。研究豬體內(nèi)IKKγ蛋白在病毒感染過程中的相互作用，需要應(yīng)用豬源IKKγ抗體，但目前全世界的生物制品市場(chǎng)中尚缺乏該抗體。【擬解決的關(guān)鍵問題】克隆NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄途徑中的IKKγ基因，經(jīng)大腸桿菌BL21原核表達(dá)獲得融合蛋白并免疫昆明小鼠以獲得效價(jià)高且特異性強(qiáng)的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究IKKγ蛋白生物學(xué)特性及揭示IKKγ蛋白與豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）間相互作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

豬瘟病毒石門株（Shimen strain）、大腸桿菌（DH5α和BL21）、原核表達(dá)載體pET-32a（+）、真核表達(dá)載體pCMV-HA及氨芐青霉素均由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。4周齡昆明小白鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。pMD18-T載體、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)、DNA Extraction Kit、LA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、蛋白純化試劑、佛氏佐劑及質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;Prime STAR高保真聚合酶、馬抗小鼠綠色熒光二抗、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶及Ni-NTA親和樹脂購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;膠回收試劑盒Gel Extraction Kit、抗HA標(biāo)簽鼠源單克隆抗體及抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;免疫熒光染色試劑盒—抗小鼠Alexa Fluor 488和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯示試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

1. 2. 1 原核表達(dá)引物設(shè)計(jì) 參照GenBank已公布的IKKγ基因序列（XM_005674035），采用Oligo 7.0設(shè)計(jì)引物，原核表達(dá)載體的上、下游引物分別插入EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，引物委托廣州華大生物技術(shù)有限公司合成。其中，上游引物IKKγ-561-E：5'-GAATTCGAGCAGGGTGCTCCTGAG-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)）;下游引物IKKγ-561-N：5'-GCGG CCGCCAGCTGGGCCAGCTTCCG-3'（下劃線為Not I酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增目的片段大小561 bp。

1. 2. 2 真核表達(dá)引物設(shè)計(jì) 參照1.2.1引物設(shè)計(jì)步驟設(shè)計(jì)真核表達(dá)引物，分別插入EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，引物委托廣州華大生物技術(shù)有限公司合成。其中，上游引物IKKγ-1356-E：5'-GAATTCGGGCCAC CATGCCGCCGCCGGAGAGAC-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)）;下游引物IKKγ-1356-N：5'-GCGGCCG CCTACTCGATACACTCCATG-3'（下劃線為Not I酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增目的片段大小1356 bp。

1. 3 克隆載體構(gòu)建

1. 3. 1 原核表達(dá)載體構(gòu)建 IKKγ基因RT-PCR擴(kuò)增：取豬腎細(xì)胞（PK-15）總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，參照Prime STAR高保真聚合酶使用說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50.0 μL：cDNA模板3.0 μL，Prime STAR 25.0 μL，IKKγ-561-E和IKKγ-561-N各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后按Gel Extraction Kit說明進(jìn)行膠回收，將膠回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取多個(gè)單克隆液體培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定，挑選陽(yáng)性菌液送至廣州華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證成功的陽(yáng)性質(zhì)粒與原核表達(dá)載體用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，在T4連接酶作用下與原核表達(dá)載體pET-32a（+）連接過夜（16 ℃），再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提原核重組質(zhì)粒用EcoR I和Not I進(jìn)行酶切鑒定，陽(yáng)性原核重組質(zhì)粒送至廣州華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1. 3. 2 真核表達(dá)載體構(gòu)建 以1.3.1反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用真核引物IKKγ-1356-E和IKKγ-1356-N進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收后克隆至pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定，挑選陽(yáng)性菌液送至廣州華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，再克隆至真核表達(dá)載體pCMV-HA上，經(jīng)EcoR I和Not I酶切鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至廣州華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1. 4 融合蛋白表達(dá)

以原核重組質(zhì)粒pET-IKKγ轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落接種于7 mL的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng);然后按1∶100比例將上述菌液接種于30 mL的LB培養(yǎng)基中，并加入0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后6 h的菌液（2 mL）放入離心管中，12000 r/min離心5 min，棄上清液，利用PBS進(jìn)行重懸，采用細(xì)胞破碎儀充分破碎，12000 r/min離心10 min。取上清液、沉淀及破碎的全菌液各100 μL置于不同的1.5 mL離心管中，加入1/5體積5×SDS的蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以空載質(zhì)粒pET-32a（+）在BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)菌液為對(duì)照。

1. 5 融合蛋白純化

由于融合蛋白IKKγ以可溶性蛋白形式表達(dá)為主，且目的蛋白含有抗His組氨酸標(biāo)簽，故采用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白IKKγ。以含20和70 mmol/L咪唑的洗滌液及含250 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，采用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化。將純化收集的上清液、穿透液和洗脫液等樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過考馬斯亮藍(lán)染色分析;同時(shí)采用Western blotting檢測(cè)分析純化透析后的融合蛋白。Western blotting檢測(cè)所用的一抗為抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體，二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG。

1. 6 免疫小鼠制備多克隆抗體

4周齡昆明小白鼠先飼養(yǎng)3～4 d以適應(yīng)新環(huán)境，減少外部應(yīng)激影響。將純化融合蛋白IKKγ與佛氏佐劑乳化成油包水乳劑，通過小鼠背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫，免疫程序按照1、7、21和42 d分4次進(jìn)行免疫。首次免疫時(shí)，融合蛋白IKKγ與佛氏佐劑等體積混合乳化，其余免疫則與佛氏不完全佐劑等體積混合乳化，每只昆明小白鼠注射約500 μg的融合蛋白IKKγ。四免后第7 d進(jìn)行昆明小白鼠眼球采血，分離血清即為制備的IKKγ多克隆抗體，按100 μL/管分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 7 豬源IKKγ多克隆抗體特異性鑒定

按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明，以真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。以1 MOI的CSFV感染80%單層培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞，刺激其產(chǎn)生IKKγ蛋白，感染2 h后換成含3%血清的DMEM，分別在0、12、24、36和48 h后收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè);同時(shí)以真核表達(dá)載體pCMV-HA轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，48 h后進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)，驗(yàn)證抗體特異性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 IKKγ原核表達(dá)基因片段選擇

根據(jù)GenBank已公布的豬IKKγ基因序列，對(duì)豬IKKγ氨基酸親水性及其抗原指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果（圖1）顯示，其核苷酸序列長(zhǎng)度1356 bp，編碼452個(gè)氨基酸殘基。選取親水性良好且具有線性表位氨基酸第76～263位點(diǎn)中的187個(gè)氨基酸殘基作為目的蛋白，用于制備多克隆抗體。

2. 2 豬IKKγ基因片段擴(kuò)增結(jié)果

采用原核表達(dá)引物IKKγ-561-E和IKKγ-561-N，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得豬IKKγ基因片段561 bp（圖2-A）;而采用真核表達(dá)引物IKKγ-1356-E和IKKγ-1356-N，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得豬IKKγ基因全長(zhǎng)序列1356 bp（圖2-B）。

2. 3 豬源IKKγ原核/真核表達(dá)載體構(gòu)建情況

原核表達(dá)載體pET-32a（+）屬于原核高效表達(dá)系統(tǒng)，由于攜帶His標(biāo)簽，Ni2+與6×His螯合后能將His標(biāo)簽特異性抗體結(jié)合至Ni-NTA純化介質(zhì)上，而未結(jié)合的蛋白被洗滌下來(lái)，從而獲得高純度的融合蛋白IKKγ。將IKKγ基因片段（561 bp）插入原核表達(dá)載體pET-32a（+）中的EcoR I和Not I多克隆位點(diǎn)，即成功構(gòu)建獲得原核重組質(zhì)粒pET-IKKγ，具體構(gòu)建流程如圖3所示。

真核表達(dá)載體pCMV-HA屬于真核高效表達(dá)系統(tǒng)，插入外源基因片段構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后即可誘導(dǎo)表達(dá)HA標(biāo)記的融合蛋白，便于利用HA標(biāo)簽抗體對(duì)融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析。將IKKγ基因全長(zhǎng)序列（1356 bp）插入真核表達(dá)載體pCMV-HA的EcoR I和Not I多克隆位點(diǎn)，即成功構(gòu)建獲得真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ，具體構(gòu)建流程如圖4所示。

2. 4 豬源IKKγ原核/真核表達(dá)載體鑒定結(jié)果

原核重組質(zhì)粒pET-IKKγ和真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ的雙酶切鑒定結(jié)果如圖5所示。其中，原核重組質(zhì)粒pET-IKKγ經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切后獲得561 bp的IKKγ基因條帶和5900 bp的原核表達(dá)載體pET-32a（+）條帶;而真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切后獲得1356 bp的IKKγ基因條帶和3800 bp的真表達(dá)載體pCMV-HA條帶。

2. 5 豬源IKKγ基因原核誘導(dǎo)表達(dá)形式鑒定結(jié)果

將原核重組質(zhì)粒pET-IKKγ轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞后，分別以含0.1 mmol/L IPTG和不含IPTG的LB培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6 h后各取1 mL菌液進(jìn)行超聲波破碎裂解，收集總菌液、上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)及考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果（圖6）顯示，重組菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能表達(dá)出約40 kD的融合蛋白，且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式進(jìn)行表達(dá)。

2. 6 融合蛋白純化與鑒定結(jié)果

將Ni-NTA親和層析純化收集的上清液、穿透液、2次洗滌液及5次蛋白洗脫液分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，融合蛋白與Ni-NTA親和層析柱結(jié)合良好;含70 mmol/L咪唑的洗滌液可洗滌掉部分雜蛋白，達(dá)到洗滌目的;含250 mmol/L咪唑的洗脫液可洗脫全部目的蛋白（圖7-A）。Western blotting鑒定結(jié)果顯示，在40 kD處有1條清晰的目的條帶（圖7-B），說明成功獲得較高純度的融合蛋白IKKγ。

2. 7 豬源IKKγ基因真核表達(dá)效果

以1∶1000稀釋的抗HA標(biāo)簽鼠源單克隆抗體為一抗，采用Western blotting檢測(cè)真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中融合蛋白IKKγ的表達(dá)情況，結(jié)果（圖8）顯示，構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ能在293T細(xì)胞中成功表達(dá)出IKKγ蛋白。

2. 8 豬源IKKγ多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

收集真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)的融合蛋白樣品，分別用1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000稀釋的豬源IKKγ多克隆抗體與其進(jìn)行Western blotting檢測(cè)分析，結(jié)果（圖9）表明，豬源IKKγ多克隆抗體可與293T細(xì)胞表達(dá)融合蛋白IKKγ發(fā)生特異性反應(yīng)，其抗體效價(jià)為1∶16000。

2. 9 豬源IKKγ多克隆抗體特異性檢測(cè)結(jié)果

采用Western blotting檢測(cè)豬源IKKγ多克隆抗體與純化后的融合蛋白IKKγ是否發(fā)生反應(yīng)，結(jié)果（圖10-A）顯示豬源IKKγ多克隆抗體的特異性良好。收集CSFV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞產(chǎn)生的IKKγ蛋白進(jìn)行Wes-tern blotting，結(jié)果表明，豬源IKKγ多克隆抗體與PK-15細(xì)胞表達(dá)的IKKγ蛋白反應(yīng)性良好，其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表達(dá)高峰期（圖10-B）。可見，制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體反應(yīng)性良好。

2. 10 豬源IKKγ多克隆抗體與PK-15細(xì)胞表達(dá)IKKγ蛋白的反應(yīng)性

真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞48 h后，以1∶300稀釋的豬源IKKγ多克隆抗體為一抗，采用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）檢測(cè)真核重組質(zhì)粒pCMV-HA-IKKγ在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，制備的豬源IKKγ多克隆抗體能在PK-15細(xì)胞中成功檢測(cè)到IKKγ蛋白（圖11），說明制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體與真核細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的IKKγ蛋白反應(yīng)性良好。

3 討論

豬源IKKγ是一個(gè)由452個(gè)氨基酸殘基組成的具有調(diào)節(jié)作用的亞基蛋白，雖然其本身不具催化作用，但I(xiàn)KK激酶復(fù)合體活性依賴于IKKγ亞單位的完整性。IKKγ與IKK激酶復(fù)合體的2個(gè)催化亞基（IKKα和IKKβ）在結(jié)構(gòu)上并無(wú)同源性（Ishrat et al.，2012）。真核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Rel/NF-κB家族廣泛存在于從昆蟲到人類的細(xì)胞中，主要參與細(xì)胞的分化、發(fā)育、凋亡、黏附及炎癥反應(yīng)。NF-κB通過與抑制分子IκB相互作用，在細(xì)胞質(zhì)中保持非活性狀態(tài)，尤其在炎癥細(xì)胞因子、細(xì)菌脂多糖、病毒感染或應(yīng)激等多種刺激下，IκB在2個(gè)關(guān)鍵絲氨酸殘基上發(fā)生磷酸化，且這種修飾可通過蛋白酶體降解機(jī)制進(jìn)行識(shí)別及破壞（Karin and Ben-Neriah，2000）。因此，游離的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，激活參與免疫和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)控制或防止凋亡等基因轉(zhuǎn)錄水平（Goto et al.，2018）。IKK激酶復(fù)合體是NF-κB的上游激酶，其激活方式為刺激依賴性，不同的上游信號(hào)激活特異IKK激酶復(fù)合體，且可能存在不同的受體及受體附近復(fù)合物等信號(hào)分子參與。如IL-1R和RIG-1均通過TRAF6將信號(hào)傳給IKK激酶復(fù)合體，但在其附近存在各自不同的受體接頭復(fù)合物，包括MyD88和MAVS（Hayden and Ghosh，2008）。

目前，制備多克隆抗體過程中高效表達(dá)目的蛋白最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)是pET-32a（+），具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效等特點(diǎn)（楊忠東和何成，2011），能在短期內(nèi)獲得大量的目的蛋白特異性抗體（耿抒賢等，2020）。本研究的預(yù)試驗(yàn)選用原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，與原核表達(dá)載體pET-32a（+）相比，二者的多克隆酶切位點(diǎn)、自帶標(biāo)簽及載體大小均不相同。原核表達(dá)載體pGEX-4T-1自帶GST標(biāo)簽，與IKKγ重組構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-IKKγ轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，融合蛋白的表達(dá)量較低，甚至出現(xiàn)不表達(dá)情況，且誘導(dǎo)表達(dá)的最適條件難以掌控，蛋白表達(dá)量未能達(dá)到免疫量要求。選用原核表達(dá)載體pET-32a（+）制備豬源IKKγ多克隆抗體的優(yōu)勢(shì)在于：（1）可制備獲得良好的免疫原蛋白，作為免疫原免疫小鼠;（2）免疫原的線性表位直接影響多克隆抗體的反應(yīng)性、特異性、親/疏水性（尹珊，2013）。本研究通過多次摸索不同溫度梯度及IPTG誘導(dǎo)濃度，最終確定在30 ℃及IPTG終濃度為0.1 mmol/L的條件下誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性蛋白濃度較高。雖然融合蛋白在低溫與低IPTG濃度條件下表達(dá)速度較慢，但更有利于其空間結(jié)構(gòu)的正確折疊，更好地保留IKKγ蛋白的免疫原性。

抗體制備是研究目的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)特性、蛋白間相互作用、蛋白亞細(xì)胞定位及蛋白生物學(xué)功能的基礎(chǔ)工作（Wootla et al.，2014）。本研究制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體具有較高親和性，包含多個(gè)線性表位，可與多個(gè)抗原決定簇結(jié)合，可用于檢測(cè)293T細(xì)胞或PK-15細(xì)胞的外源性和內(nèi)源性IKKγ蛋白水平，即豬源IKKγ多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性和較強(qiáng)的特異性。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，IKKγ蛋白在CSFV感染PK-15細(xì)胞中的表達(dá)水平較在正常PK-15細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯上升，IKKγ蛋白可能在與CSFV蛋白互作過程中發(fā)揮重要作用。可見，利用制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體有助于進(jìn)一步拓展IKKγ蛋白生物學(xué)特性及NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制研究。

4 結(jié)論

制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體具有效價(jià)高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于檢測(cè)CSFV感染PK-15細(xì)胞中IKKγ蛋白表達(dá)水平，為下一步研究IKKγ蛋白生物學(xué)特性及揭示NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能機(jī)制提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）