HSP90及c-Myc在小鼠腸道腺瘤癌變中的表達及相關性

沈曉東 張天 邊濤

結直腸癌是全世界第3大高發惡性腫瘤，每年新診斷病例高達1200萬［1］，在惡性腫瘤中病死率在全世界居第4位［2］。大量研究表明，WNT信號通路中β-catenin 及c-Myc等活性升高是大多數結直腸腺瘤癌變及結直腸癌形成及進展的重要特征［3-4］，其發病機制與MYC等原癌基因及APC等抑癌基因發生突變有關［4］，c-MYC是這些信號通路最重要的癌基因之一［5］。ApcΔ716/+小鼠模型具備典型的息肉-腺瘤-癌變過程，并且有與人類高度同源性、遺傳性強、操作簡便等優點，是國際公認的研究結直腸腺瘤癌變及結直腸癌的小鼠模型［6］。熱休克蛋白作為分子伴侶與發生變性的蛋白結合而維持其正常的結構和功能，可分為HSP90、HSP70、小分子HSP等，其中HSP90在很多惡性腫瘤中表達明顯升高，并且在惡性腫瘤的發生、發展及免疫反應中起著重要的作用［7］。本研究采用ApcΔ716/+小鼠，研究腸道腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的表達情況及相關性，為HSP90應用于預防腸道腺瘤癌變提供重要的理論依據。

1 實驗方法

1.1 材料 HSP90鼠抗人單克隆抗體（ab13492）由艾博抗公司提供，c-Myc鼠抗人單克隆抗體（sc-40）圣克魯斯生物技術公司提供，ECL發光試劑盒由阿默舍姆制藥生物技術公司提供，標第一鏈合成系統Ⅱ由賽默飛生命科學公司提供，其他試劑均為實驗用。

1.2 方法 （1）動物：ApcΔ716/+小鼠由Oshima教授饋贈，小鼠繁殖及擴增在SPF環境中，ApcΔ716/+雄性小鼠及野生型雌性小鼠進行交配擴增，剪取尾尖基因鑒定，選出ApcΔ716/+小鼠作為本實驗用。（2）腸道腺瘤癌變的判定：通過對2～12周ApcΔ716/+小鼠腸道標本進行體視顯微鏡以及HE染色檢測發現，4周開始出現腸道腺瘤，5～7周小鼠腸道腺瘤均為良性；8周時腺瘤開始出現癌變，癌變數為1～3枚/只，腺瘤癌變與大小有直接相關，故選取8周最大的腸息肉作為癌變的息肉（同時切取小部分HE染色證明其已經發生癌變），選取5周的1.0mm腸道良性腺瘤作為對照。

1.3 Western blot法檢測腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的表達 通過體視顯微鏡采取5周正常黏膜、良性腺瘤及8周癌變息肉，細胞提取物通過10% SDSPAGE凝膠電泳分離及半干式轉膜轉膜，第一抗體選用鼠抗人HSP90及c-Myc抗體，滴加二抗，ECL發光試劑檢測結果。

1.4 腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc免疫組織化學染色 選取5周及8周小鼠各8只，處死后分離腸道，福爾馬林固定，石蠟包埋，5μm切片，通過HE染色明確腺瘤癌變部位；滴加HSP90或c-Myc單克隆抗體，4℃冰箱密封過夜，滴加二抗，溫育30min后DAB顯色。染色陽性判定標準：棕黃色顆粒沉積的部位為染色陽性，腫瘤細胞c-Myc全部為細胞核著色，HSP90則絕大部分細胞核染色，少部分腫瘤細胞細胞質輕微著色。HSP90及c-Myc蛋白質的相對表達量由染色細胞比率及著色強度的乘積來判定，由兩名專業人員雙盲下評分。

1.5 RT-PCR法檢測腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的 mRNA 選取5周及8周ApcΔ716/+小鼠各16只，處死小鼠后，無RNA酶條件下分離出整個腸道，體視顯微鏡下切取5周小鼠良性腺瘤及8周癌變的息肉，Trizol 試劑盒提取總RNA，標第一鏈合成系統Ⅱ試劑盒合成Hsp90及c-Myc的cDNA，Hsp90及c-Myc的引物應用ABI PRISM引物設計軟件確定，PCR擴增后使用ABI PRISM? 7000 型序列檢測系統檢測PCR反應結果。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料采用t檢驗或方差分析檢驗；相關性分析采用Pearson檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ApcΔ716/+小鼠腸道腺瘤癌變情況 4周開始出現腸道腺瘤，5周腺瘤總數為（7.6±3.1）個，均為良性腺瘤；8周小鼠腸道息肉總數為（68.8±12.8）個/只，其中出現癌變者（1.7±1.1）個/只，惡變與體積大小相關，體積較大者首先開始癌變。

2.2 腸道腺瘤癌變組織中的HSP90及c-Myc蛋白表達 通過蛋白電泳發現，正常腸黏膜HSP90及c-Myc表達量低，條帶顯示淡；5周時腺瘤內HSP90及c-Myc表達量升高，8周腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc蛋白條帶明顯增強，與良性腺瘤比較比較明顯不同，見圖1。

圖1 HSP90及c-Myc在腸道腺瘤及腺瘤癌變組織中的表達

2.3 腸道腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc免疫組織化學染色 腺瘤癌變組織中HSP90染色陽性細胞明顯增多，染色增強，絕大部分位于細胞核內，少部分位于細胞質內，其相對表達量為（6.91±1.19），較良性腺瘤（1.70±0.61）顯著升高（t=-11.038，P＜0.001）；c-Myc免疫組織化學染色結果與HSP90相似，腺瘤癌變組織中c-Myc表達也明顯增多，主要位于細胞核內，其相對表達量為（7.31±1.22），較良性腺瘤（2.14±0.80）也顯著升高（t=-9.722，P＜0.001），見圖2。

2.4 腸道腺瘤及腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的mRNA表達 腺瘤癌變組織中HSP90 mRNA表達量為（0.62±0.08），較良性腺瘤（0.21±0.06）明顯升高（t=-17.246，P＜0.001）；腺瘤癌變組織中 c-Myc的mRNA表達量為（0.95±0.10），也較良性腺瘤（0.31±0.05）明顯升高（t=-23.917，P＜0.001）。

2.5 腸道腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc表達的相關性 將腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的mRNA相對值等結果進行相關性分析，結果顯示HSP90及c-Myc的mRNA表達存在明顯的正相關（r=0.710，P=0.002）。同樣，對免疫組織化學染色中HSP90及c-Myc的相對表達量相關性進行分析，結果與mRNA相對值相似（r=0.925，P=0.001）。

圖2 腸道腺瘤及腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc免疫組織化學染色

3 討論

目前HSP90在腫瘤方面研究日益深入，HSP90不僅在多種惡性腫瘤免疫治療中起到重要的作用，血漿HSP90還可作為腫瘤標志物用于許多惡性腫瘤的診斷，HSP90-多肽復合物對胃腸道惡性腫瘤具有明確的抗腫瘤活性，并已經進入臨床試驗階段，故HSP90適合作為腸道腺瘤癌變及結直腸癌免疫治療的靶點而進一步深入研究。

原癌基因MYC突變后，其編碼的蛋白c-Myc可以介導生物信號由細胞外轉導入細胞核內，在腫瘤的形成及發展中起到重要的作用；大量研究表明c-Myc在腸道腺瘤形成及癌變中起到重要作用［8］；HSP90則通過c-Myc 參與很多惡性腫瘤的發生及發展過程［9］；本研究通過檢測HSP90及c-Myc在ApcΔ716/+小鼠腸道腺瘤癌變組織中的表達及相關性，推測HSP90在腸道腺瘤癌變中的作用機制，為防治腸道腺瘤癌變提供新選擇。

本實驗中，在8周左右ApcΔ716/+小鼠腺瘤剛開始出現癌變，通過蛋白電泳、免疫組織化學染色及RT-PCR等實驗方法證明，腺瘤出現癌變時，無論在mRNA水平還是在蛋白質水平HSP90及c-Myc均較良性腺瘤時顯著升高；并且腺瘤癌變組織中，HSP90與c-Myc的mRNA表達及蛋白質表達均具有明顯相關性，說明HSP90可能通過與c-Myc相互作用，參與腸道腺瘤癌變的調控。

HSP90參與腸道腺瘤癌變的機制目前尚不明確，Poole教授等［9］研究表明Myc-HSP90軸是維持許多惡性腫瘤發生及發展的關鍵，本實驗研究結果與Poole教授的研究結果相似，HSP90及c-Myc在腸道腺瘤癌變組織中顯著升高并具有相關性，提示HSP90可能通過c-Myc參與腸道腺瘤癌變，其作用機制可能有以下幾個方面：（1）HSP90作為分子伴侶維持c-Myc正常構象及功能，促進腫瘤惡變，這可能是主要機制；（2）HSP90通過表觀遺傳過程參與c-Myc的轉錄調控，促進c-Myc的轉錄及翻譯，提高c-Myc表達水平；（3）HSP90通過與一些轉錄因子相互作用，提高c-Myc的mRNA穩定性。但現階段HSP90與c-Myc間具體信號通路尚不完全清楚，需要進一步研究明確HSP90 促進腸道腺瘤癌變的具體機制。

本研究中，在8周ApcΔ716/+小鼠腸道腺瘤開始出現癌變時，腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的mRNA及蛋白質表達水平均較良性腺瘤顯著升高，并且HSP90及c-Myc的表達具有明顯相關性，提示HSP90通過c-Myc參與腸道腺瘤癌變。本研究探索了HSP90在腸道腺瘤癌變中表達的及作用機制，為預防腸道腺瘤癌變提供新策略。