植物根際促生細菌對蒲兒根富集銅及土壤理化性質的影響

沈 甜，王瓊瑤，崔永亮，閆 敏，李雨昕，涂衛國，張 芳，王 娟，余秀梅*

（1.四川農業大學資源學院，成都 611130；2.四川省自然資源科學研究院，成都 610041）

銅（Cu）是動植物必需的微量營養元素之一，但也是一種環境污染元素[1-3]，過量的Cu會對植物、動物、人體造成危害。土壤Cu污染不僅會降低土壤營養成分，打破土壤植物和微生物的生態平衡，還會通過食物鏈的富集作用危害人體健康[2，4-5]。近年來，隨著工農業的快速發展，土壤Cu污染問題突出，而有效的土壤Cu污染修復技術的研究與應用相對較少。

微生物-植物聯合修復既能克服單植物修復緩慢和單微生物修復有風險的缺點，還具有修復成本低、效率高的優點，因而成為研究熱點[1，6-7]。其中，植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）[8]與植物聯合修復土壤重金屬污染土壤的協同作用體現在兩方面：第一，PGPR通過分泌鐵載體、生物表面活性劑、誘導植物系統抗性、激活抗氧化酶活性等作用，直接促進植物生長和增強植物對重金屬的抗性，強化重金屬污染土壤植物修復效率；第二，PGPR通過改變植物所處土壤環境中重金屬的形態和遷移率，間接減緩土壤重金屬離子對植物的毒害作用[9-13]。

目前，已被發現且能應用于重金屬污染修復的超富集植物約400多種[14]。蒲兒根（Sinosenecio oldhamianus）是蒲兒根屬兩年生草本植物，具有生命力旺盛、易于存活、生長繁殖速度較快的優點，且其在修復重金屬污染過程中具有投入成本低、效率高、無二次污染等優勢[15-19]。張世熔等[20]研究發現，蒲兒根由于根系發達，可以在礦區土壤和污泥中存活的同時富集大量的Cu，并將其轉移到地上部分，有效修復Cu污染土壤。為了進一步研究PGPR是否可以強化蒲兒根修復Cu污染土壤，本研究通過開展多功能PGPR混合菌劑-蒲兒根聯合修復不同Cu含量土壤的盆栽模擬試驗，分析多功能PGPR混合菌劑對蒲兒根生長、富集Cu效率及土壤性質的影響，評估多功能PGPR混合菌劑在蒲兒根富集土壤中Cu的強化作用，為進一步應用蒲兒根-PGPR聯合高效修復Cu污染土壤提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

盆栽土壤是將蛭石和泥炭土以1∶2的比例混勻后按土壤質量和試驗處理濃度加入CuSO4·5H2O，每盆分裝混勻后的土壤5 kg，并澆灌足量的水穩定40 d后獲得[21]。盆栽土壤理化性質：pH=7.2、有機質含量22.23 g·kg-1、全磷含量13.55%、有效磷含量34.77 mg·kg-1、全氮含量0.67%、水解氮含量401.45 mg·kg-1、全鉀含量1.26%、速效鉀含量905.00 mg·kg-1；蒲兒根幼苗購買自溫江花鳥市場；PGPR混合菌劑菌株來自四川農業大學資源學院，由一株解鉀菌WDGJ-11（Gen-Bank序列號：KJ733990）、一株溶磷菌 WDN-5（Gen-Bank序列號：KJ733968）、一株蒼白桿菌MGJ11（Gen-Bank序列號：KX929163）混合組成，已進行拮抗實驗驗證三株菌之間不產生拮抗反應。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化及功能驗證

采用牛肉膏培養基（牛肉膏：3.0 g；蛋白胨：10.0 g；NaCl：5.0 g；瓊脂：20 g；水：1000 mL；pH：7.4～7.6）活化菌株。采用Salkowski法測定菌株產吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）能力[22]，采用硅酸鹽培養法測定菌株的解鉀能力[23]，采用菌碟法測定菌株的解磷能力[24]，同時測定三株菌對重金屬Cu的最高耐受濃度[25]。菌劑采用牛肉膏液體培養基制備。

1.2.2 盆栽試驗

將植物育苗、移栽。選取CuSO4·5H2O作為供試藥品，設置6個處理水平分別為0、200、400、600、800、1000、1200 mg·kg-1，每個水平分別設立添加PGPR混合菌劑（PGPR）和不添加PGPR混合菌劑（CK）2個試驗組互為對照。分別取每株細菌培養的新鮮菌懸液50 mL（約1011cfu·mL-1）混合均勻后稀釋到2 L，澆灌盆栽蒲兒根，再用無菌的石英砂覆蓋盆栽土。為排除菌劑中的培養基營養成分的影響，CK組施用等量不含菌株的牛肉膏液體培養基150 mL稀釋到2 L。每個試驗組設置5次重復。于恒溫25℃、光照12 h·d-1的光照培養室培養3個月后采集植物樣品和土壤樣品進行理化性質和重金屬等指標測試。

1.2.3 測試指標

蒲兒根生長狀況測定：采集植物樣品洗凈后置于干凈平臺上，用卷尺測量每一株蒲兒根的株高以及根長；植物樣品氮磷鉀測定：105℃殺青2 h后80℃烘干，磨細混勻保存。植物樣品采用H2SO4-H2O2消煮法消解，植物全氮采用靛酚藍比色法、全磷采用釩鉬黃比色法、全鉀采用火焰光度法進行測定[22]；土壤理化性質的測定：采集盆栽土壤，自然風干，磨細混勻保存。土壤有機質采用重鉻酸鉀容量法、pH值采用電位法測定、全氮采用凱氏定氮法、全磷采用酸溶-鉬銻抗比色法、全鉀采用NaOH-火焰光度法、堿解氮采用堿解擴散法、有效磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法、速效鉀采用1 mol·L-1中性NH4OAc浸提-火焰光度法進行測定[26]；土壤酶活的測定：采集盆栽新鮮土樣測定土壤酶活性，脲酶采用靛酚比色法、蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法、過氧化氫酶采用鄰苯三酚比色法、磷酸酶采用磷酸苯二鈉法[27]；植物重金屬含量測定：植物樣經混酸（V HNO3∶V HClO4=4∶1）消解后ICP-OES上機測定重金屬含量，以國家標準重金屬溶液作參比。

1.3 數據處理

本試驗的數據采用Excel 2010、SPSS22.0進行分析處理。

圖1 不同處理的蒲兒根生長狀況Figure 1 Plant growth condition of Sinosenecio oldhamianus of different treatments

2 結果與分析

2.1 PGPR的促生活性驗證和耐Cu測試

對三株菌進行促生活性驗證，在產IAA能力檢測中，培養3 d后蒼白桿菌MGJ11、解鉀菌WDGJ-11、溶磷菌WDN-5產IAA的量分別為83.05、44.13、38.50 mg·mL-1。另外，解鉀菌WDGJ-11培養6 d后分泌產生的有效鉀濃度為31.32μg·mL-1，溶磷菌WDN-5培養7 d后分泌產生的有效磷濃度為64.89μg·mL-1。

對三株菌進行耐Cu測試，確保菌株能在后續試驗條件下存活。不同濃度含Cu培養基培養3 d后檢測菌株存活狀況，蒼白桿菌MGJ11、解鉀菌WDGJ-11、溶磷菌WDN-5對重金屬Cu的最小抑制濃度（Minimal inhibit concentration，MIC）分別為100、200、200 mg·kg-1，最小致死濃度（Minimum lethal concentration，MLC）分別為1350、1300、1400 mg·kg-1。

2.2 蒲兒根植株生長生物指標及金屬富集特征

由圖1可知在Cu脅迫下隨著土壤Cu含量上升蒲兒根根長、株高都大致呈現先升后降的趨勢，且可以明顯觀察到施加PGPR混合菌劑的植株長勢均優于未加PGPR混合菌劑的植株，加入PGPR混合菌劑的植株比CK組的植株株高平均高7.45 cm，根長平均長2.72 cm。與土壤Cu含量為0 mg·kg-1的處理相比，其余處理下的蒲兒根長勢皆比其優，這是因為Cu作為植物生長必需元素之一，能促進植物的生長，促生作用在土壤Cu含量為600 mg·kg-1時達到最佳。由此可知，蒲兒根對于土壤Cu具有較高的耐受性，PGPR混合菌劑的加入可以促進植物生長并增強其對土壤Cu的耐受性。

由表1可見，與不加入PGPR混合菌劑的處理相比，加入PGPR混合菌劑處理的植株各部分磷、鉀含量均升高，且大部分顯著提高（P＜0.05），但PGPR組植株地上部分氮含量僅在土壤Cu含量為0～600 mg·kg-1時顯著提高，植株地下部分氮含量在土壤Cu含量為 0、200、600 mg·kg-1時顯著（P＜0.05）高于 CK組。結合蒲兒根生長狀況，植物營養元素含量均在土壤Cu含量為600 mg·kg-1時達到最高值。在土壤Cu含量低于800 mg·kg-1時，PGPR混合菌劑的促生作用明顯，在土壤Cu含量大于800 mg·kg-1的高濃度脅迫下，微生物和植物的生長均受到了一定程度的限制，所以PGPR混合菌劑對植物生長的促進作用有所降低。

由圖2可知，兩個處理下蒲兒根對Cu的富集量均隨土壤Cu含量的升高呈現增長趨勢，對Cu的富集作用主要集中在根系，只有約18%轉移到地上部分，地上部分差異不明顯，表明PGPR菌劑的加入對植物根部吸收土壤Cu有很大的促進作用，對地上部分影響不大。CK組地下部分Cu含量在土壤Cu含量200～1200 mg·kg-1都沒有太大區別，穩定在60 mg·kg-1左右。施加混合菌劑處理的地下部分Cu含量均高于CK組，在土壤Cu含量為800 mg·kg-1的時候蒲兒根地下部分重金屬含量達到了176.17 mg·kg-1，表明PGPR混合菌劑的加入不僅對蒲兒根生長有促進作用，且使得植株地下部分吸收土壤Cu的能力有很大提高，在0～800 mg·kg-1范圍內土壤Cu含量越高，促進作用越明顯。在土壤Cu含量為800～1200 mg·kg-1時，植物體內重金屬含量由于高濃度Cu脅迫呈現下降趨勢。

進一步計算蒲兒根對土壤重金屬的富集系數。富集系數表示植物累積Cu的能力，計算植物體內Cu富集系數來評估不同處理下蒲兒根的富集能力，計算公式如下：

表1 不同處理的蒲兒根氮、磷、鉀含量Table 1 The nitrogen，phosphorus and potassiumcontent of Sinosenecio oldhamianus of different treatments

圖2 不同處理的蒲兒根Cu富集量Figure 2 Copper accumulation of Sinosenecio oldhamianus of different treatments

圖3顯示了蒲兒根在不同Cu含量處理下的富集系數，總體而言，PGPR組的蒲兒根對Cu的富集系數皆高于CK組，可見，PGPR混合菌劑的加入可以明顯提高蒲兒根對土壤中Cu的富集能力。土壤Cu含量為200 mg·kg-1時，蒲兒根的富集系數達到了44.36%，比未加菌劑的處理提高了12.93%，其后有一個降低的趨勢，而在800 mg·kg-1的時候達到了22.72%，是整個試驗中的第二個高點，比未加菌劑處理的富集系數提高14.01%。結合蒲兒根的生長趨勢，土壤中的Cu含量在低濃度時可以促進植物生長發育，在高濃度脅迫下，PGPR混合菌劑不但促進了植物的生長和對重金屬Cu的耐受性，還提高了植物對重金屬Cu的吸收量。

2.3 土壤理化性質的變化

測定不同Cu濃度處理下的土壤pH值，均在7.1～7.4，變化不明顯。

圖3 不同處理的蒲兒根銅富集系數Figure 3 Copper concentration factor of Sinosenecio oldhamianus of different treatments

表2 不同處理的土壤氮含量Table 2 Soil nitrogen content of different treatments

由圖4可知，加入PGPR混合菌劑后土壤有機質顯著提高，在土壤Cu含量0、600、800、1000 mg·kg-1的時候有機質含量顯著（P＜0.05）高于同濃度不加菌劑的處理，且在整個試驗濃度中呈現先增后減的趨勢，這與植物生長狀況變化有一定相似性。

由表2可知，施加PGPR混合菌劑的土壤全氮、堿解氮的含量均高于未施加菌劑的處理，且土壤全氮含量在土壤Cu含量為0、200、400、1200 mg·kg-1的時候顯著（P＜0.05）高于對照組，土壤堿解氮含量在土壤Cu含量為200、400、600、1200 mg·kg-1時達到顯著（P＜0.05），在土壤Cu含量為800、1000 mg·kg-1的時候，施加PGPR混合菌劑的土壤全氮、堿解氮含量高于未施加的處理但未達到顯著水平（P＜0.05）。可見PGPR混合菌劑的加入一定程度上提高了土壤全氮和堿解氮的含量，且在土壤高含量Cu處理下依舊發揮作用。

如表3所示，除了土壤Cu含量0 mg·kg-1的處理，其余條件下施加PGPR混合菌劑處理土壤的全磷、有效磷含量均高于CK組，且在土壤Cu含量為200 mg·kg-1的時候達到顯著（P＜0.05）。在土壤Cu含量為0 mg·kg-1的處理中，施加PGPR混合菌劑處理的全磷含量顯著低于（P＜0.05）CK組，但是有效磷的含量顯著高于未接菌的處理（P＜0.05），可能是因為植物根際促生菌在土壤Cu含量為0 mg·kg-1的時候活性最高，將土壤中的全磷大量轉為植物可吸收利用的有效磷導致。

圖4 不同處理的土壤有機質含量Figure 4 Organic matter content of different treatments

表3 不同處理的土壤磷含量Table 3 Soil phosphorus content of different treatments

如表4所示，施加PGPR混合菌劑處理的土壤速效鉀含量均高于CK組，且在土壤Cu含量為200、400 mg·kg-1的時候達到顯著水平（P＜0.05）。與土壤磷含量變化趨勢相近，土壤全鉀含量在土壤Cu含量為0、200 mg·kg-1時，施加PGPR混合菌劑的土壤全鉀含量顯著低于（P＜0.05）CK組，但是速效鉀的含量高于未接菌的處理，表明在土壤Cu含量較低條件下PGPR活性很高，將大量的難溶性鉀鹽轉化為可被植物吸收的速效鉀，土壤中的鉀被植物吸收轉移，故全鉀含量有所變化。在土壤Cu含量大于400 mg·kg-1的時候，PGPR組的土壤速效鉀含量大于CK組，推測原因為微生物混合菌劑的加入降低了土壤中鉀素的流失，使原本容易隨水分流失的鉀離子被固定。

圖5 不同處理的土壤酶活性Figure 5 Soil enzyme activities of different treatments

表4 不同處理的土壤鉀含量Table 4 Soil potassium content of different treatments

不同土壤Cu含量處理下土壤的各種功能性酶活性如圖5所示。土壤過氧化氫酶活性在不同處理下不存在顯著性差異，均在0.55～0.57 g·kg-1；在土壤Cu含量為0、200、400、1000 mg·kg-1的時候，施加PGPR混合菌劑的土壤脲酶活性顯著高于CK組，而在其他濃度條件處理下（600、800、1200 mg·kg-1）施加混合菌劑的盆栽土壤脲酶活性高于CK組但未達到顯著水平；施加PGPR混合菌劑的土壤蛋白酶活性均高于同濃度的不施加菌劑的處理，且在Cu含量為0、1200 mg·kg-1時差異顯著；在各個土壤Cu含量濃度處理下，施加PGPR混合菌劑處理的土壤蔗糖酶活性皆高于同濃度不施加菌劑的處理，且在土壤Cu濃度為0、400、800 mg·kg-1的時候達到顯著；施加PGPR混合菌劑處理的土壤磷酸酶活性皆高于不施肥加菌劑的處理，且在土壤Cu含量為0、400 mg·kg-1的時候達到顯著。

總體而言，PGPR混合菌劑的加入，提升了土壤中的各種功能性酶的活性，使得土壤中部分原本不能夠被植物吸收利用的養分轉化為對植物生長有利的養分，從而促進植物的生長發育，進一步提升植物富集土壤中Cu的能力。

3 討論

本研究結果表明，植物根際促生菌與蒲兒根聯合修復土壤Cu污染效果顯著優于單一植物修復，且蒲兒根對Cu的富集作用主要集中在根系，這與張世熔等[20]研究的植株中大部分富集的重金屬Cu轉移至地上部分不符合，推測產生這種情況的原因是PGPR混合菌劑的加入極大地促進了蒲兒根地下部分的富集能力，導致大量的Cu累積在蒲兒根根部，結合其他學者[17，20]的研究結果蒲兒根還具有較強的遷移能力，推測隨時間推移，累積在根部的Cu會向地上部分轉移。

施用了PGPR混合菌劑的蒲兒根株高、根長以及氮、磷、鉀含量均優于未施加菌劑的對照組，表明植物根際促生菌的加入可以提高植物的生物量，再結合土壤氮、磷、鉀等養分含量變化分析，施加PGPR混合菌劑土壤中的植物可利用養分含量得到了很大程度提高，例如堿解氮、有效磷、速效鉀均有所增加。表明植物根際促生菌可以通過產生利于植物生理活動的有關物質或將土壤中部分難以利用的物質轉換為植物可利用的形態，提高植物可利用營養元素水平[10-12，25]，土壤速效養分的提高使得植物生長條件更優越，且PGPR混合菌劑在土壤高濃度Cu的脅迫下依舊產生作用。施加PGPR混合菌劑處理的蒲兒根對土壤中高濃度Cu的耐受性和富集量皆高于未施加混合菌劑的處理，各個處理下Cu的富集系數均高于相應對照組，特別是植物根部的富集系數顯著高于未添加菌劑的處理，推測是因為植物根際促生菌的加入增強了蒲兒根對土壤中Cu的抗性和吸附能力，某些對重金屬有較強耐受性的植物根際促生菌，可以通過吸收、淋濾等作用改變環境中金屬離子的形態，從而減輕了重金屬對植物的毒害作用[28-29]。

土壤酶是一種生物活性物質，在土壤中碳的轉化、養分循環和微生物豐度中起到關鍵作用，與土壤微生態環境息息相關，同時也是反映土壤肥力的重要指標之一[30-31]。加入植物根際促生菌處理的土壤脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、磷酸酶活性都顯著提高，活性增加最高分別為80.28%、217.11%、43.26%、61.89%。土壤脲酶酶促反應的產物為氨，其活性代表著土壤氮從有機態向有效態轉化的能力[32-33]，土壤蛋白酶也與植物氮源相關，其參與土壤中氨基酸、蛋白質以及其他含蛋白質氮的有機化合物的轉化[33]。施加PGPR混合菌劑處理的土壤脲酶和蛋白酶活性均高于CK組，且土壤堿解氮含量有了顯著提高，表明PGPR菌劑的加入很好地促進了土壤脲酶和蛋白酶的酶活性。蔗糖酶可以表征土壤生物活性強度[34]。土壤磷酸酶可以水解土壤中的有機磷酯，將土壤中的有機磷轉化為植物可吸收的無機磷[32]。PGPR混合菌劑的加入對土壤蔗糖酶和磷酸酶活性的促進作用在土壤Cu含量0～600 mg·kg-1時表現為顯著，在土壤Cu含量800 mg·kg-1的時候蔗糖酶活性促進作用表現為顯著，磷酸酶無明顯差異，在土壤Cu含量1000～1200 mg·kg-1時均無明顯差異，結合土壤有效磷含量在土壤Cu含量低濃度時顯著提高，表明PGPR混合菌劑在土壤Cu含量低于600 mg·kg-1時對蔗糖酶和磷酸酶活性的促進作用較好。試驗結果表明，接種PGPR混合菌劑后土壤微環境得到改善，土壤酶活的提升使土壤中可被植物利用的營養物質明顯增加，有效促進了蒲兒根的生長。

另外Cu是多種酶的組成成分，唐偉[35]研究發現低濃度的Cu可以激活土壤酶活，本試驗結果中脲酶和蔗糖酶的活性在不接菌的處理中出現了先增后減的趨勢，表明一定條件下，Cu對酶活性有激活作用。而Cu對土壤酶活性的抑制有兩方面：一是Cu與酶分子活性部位結合跟底物產生競爭，二是Cu抑制了土壤微生物的生長，從而減少微生物對酶的合成[36]。本試驗中土壤Cu對蛋白酶和磷酸酶出現了明顯的抑制作用，但對蔗糖酶幾乎沒有抑制作用，且體現不同程度的激活作用。土壤Cu對脲酶的影響在所有CK處理組中不顯著，在PGPR處理組中出現了抑制作用，可能是由于加入的PGPR菌劑受到了Cu的脅迫。

本研究試驗土壤Cu含量0～1200 mg·kg-1范圍中整個修復體系的營養元素指標以及重金屬富集量均呈現先增后減的趨勢，且在600 mg·kg-1的時候達到最高值，推測是因為Cu本身是植物生長所必需的元素之一，但過量的Cu依舊會損害植物的生長。在整個試驗過程中，未出現蒲兒根由于土壤重金屬含量過高而死亡的情況，驗證了蒲兒根是一種具有高耐受性的超富集植物，在土壤重金屬污染研究方面具有很大的潛力。

綜上所述，植物根際促生細菌聯合蒲兒根修復土壤Cu污染的效果明顯優于單純的植物修復，具有可行性。因此，蒲兒根-微生物共生體系可以在不同Cu含量土壤上進行穩定的修復，為Cu污染土壤的修復體系提供了依據，可作進一步研究與推廣。

4 結論

（1）植物根際促生菌與蒲兒根建立互利共生的關系，PGPR混合菌劑的加入可以改善重金屬脅迫下蒲兒根的長勢，改變蒲兒根對土壤中重金屬的富集特性，由將富集的Cu大部分轉移到地上部分改變為富集更多的Cu累積在根部，對蒲兒根富集Cu的能力有很大提升。

（2）PGPR混合菌劑的加入可以改善土壤環境，提高土壤中有效養分（堿解氮、有效磷、速效鉀）和有機質的含量，還能不同程度地提高土壤脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、磷酸酶活性。

（3）Cu作為植物生長必需的微量元素之一和某些酶的組成成分，土壤Cu含量低的時候對植物生長表現出一定的促進作用，Cu還激活了土壤中的蔗糖酶活性。