異煙肼片仿制藥質量研究和參比制劑的選擇＊

劉小燕，王 娟，張曉明，常 琦，張義福，楊平榮

（1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000）

仿制藥質量的差異直接影響群眾用藥的安全性和有效性。為整體提升我國藥品質量水平,《國家藥品安全“十二五”規劃》明確提出把全面提高仿制藥質量作為一項重要任務[1]。異煙肼，化學名4-吡啶甲酰肼，是結核病聯合治療中的首選藥。本品分子量小137.14，口服后幾乎完全吸收，生物利用度達90%[2]。國內異煙肼片批準文號數571 個，涉及生產企業331 個，有500mg,300mg，100mg，50mg 四個規格，臨床首選規格為100mg。屬于289 目錄品種之一[3]。截至3 月13 日，異煙肼片參比制劑備案記錄共52條，涉及生產企業數24 個。有12 家企業申報一致性評價，通過一致性評價的有6 家企業，涉及8 個受理號，包括100mg6 個，300mg2 個。目前，均已納入《中國上市藥品目錄集》。筆者以異煙肼片為例，對異煙肼片仿制藥體外質量研究進行了總結分析，并對參比制劑的選擇提出建議，期望對我國仿制藥質量一致性評價提供參考。

1 品種概況

根據美國兒童健康和人類發展研究所(NICHD) 和美國FDA BCS（2011 年）分類[4]及WHO（2005 年）的研究[5]，異煙肼為BCSⅠ或BCSⅢ類。報道指出異煙肼不存在多種晶型[6]。FDA 和WHO 指出，經過長期的臨床有效性驗證，異煙肼片可以通過體外溶出曲線的方法來評價與參比制劑的一致性，不推薦體內試驗，可以生物等效性（bioequivalence,BE）豁免[6,7]。國家藥品監督管理局（NMPA）也提出異煙肼片可申請豁免人體BE 研究[8]。因此，體外藥學研究則是評價異煙肼片一致性最主要的手段。

NMPA 發布的異煙肼片100mg，300mg 推薦的參比制劑為FDA 指定的參比制劑(RLD)：SANDOZ INC（山德士），現已撤市。針對這種RLD 不能獲得的情況，FDA 于2017 年引入了對照標準制劑（RS）。其中異煙肼片的RS 為BARR LABORATORIES INC。FDA 指定RS 僅用于作為仿制藥申請（abbreviated newdrugapplication，ANDA）時進行BE 研究的對照制劑，體外藥學研究還應與RLD 進行對比[9]。NMPA 之后又增補了 BARR LABORATORIES INC/Teva Pharmaceuticals USA,Inc.（梯瓦）異煙肼片同時作為我國參比制劑之一。目前50mg,500mg 異煙肼片沒有推薦參比制劑。

2 仿制藥質量研究

2.1 雜質分析

異煙肼合成路線主要有兩條，如圖1 所示[10]。

圖1 異煙肼合成路線圖

異煙肼及其片劑主要已知雜質有8 種，見表1。除了未反應的起始原料，在合成過程中會進一步產生的反應中間體，降解產物，副產物及相容性產物等。

表1 異煙肼及其片劑已知雜質及歸屬

2.1.1 游離肼

游離肼可在原料合成時引入，也可在儲存過程中由異煙肼降解產生，肼是一種誘變劑和致癌物質[11]。因此，對游離肼含量的控制是評價異煙肼及其制劑質量的重要指標之一。國內外標準中有三種檢測方法：濁度法、TLC 及柱前衍生HPLC 法，見表2。

表2 異煙肼及異煙肼片國內外標準比較

僅ChP2015 在異煙肼及其片劑中都設有游離肼檢查項。其中JP17 目視濁度法不能客觀反映游離肼真實含量，而ChP2015 采用的TLC 法檢測靈敏度較低。此前，中國國家藥典委員會已擬定提高異煙肼及其制劑質量標準[12]。

HPLC 法是利用游離肼與苯甲醛反應生成的苯甲醛吖嗪進行色譜分析測定，該方法準確性好,專屬性強,靈敏度高[13]。已有國內企業在申報異煙肼片一致性評價的注冊標準中將游離肼測定法修訂為HPLC 法，設定限度低至0.0015%，等同于BP2020/EP10.0 對原料藥中游離肼的限度：15ppm。這或許預示著我國仿制藥質量在雜質控制方面有了較大提高。客觀、合理的質量控制限度的制定，還需結合仿制藥與參比制劑穩定性試驗中游離肼的測定數據，以保證產品在有效期內達到限度要求。

2.1.2 有關物質

1）雜質譜分析。有關物質是藥品關鍵質量屬性之一，對藥品安全性和質量可控性有著重要影響。國內外藥典對異煙肼有關物質的質量控制差異較大。比較之下，BP2020/EP10.0 的質控限度較為嚴格。僅ChP2015 在異煙肼片中設定有關物質檢查項，其余藥典均未在片劑中控制有關物質（見表2）。

在前期研究工作中，筆者測定了包括異煙肼和山德士、日本第一三共在內的20 家企業異煙肼片的有關物質。山德士異煙肼片檢出一特有雜質，含量高達3.1%，經LC-MS 結構確證為異煙肼與乳糖原輔料相容性產物——乳糖異煙腙。而17 批國內異煙肼片檢出未知雜質在0.2%以上的有2 家，涉及3 種雜質；異煙肼及所有異煙肼片中均檢出異煙酸、異煙酰胺，而4-甲基吡啶及USP43 與BP2020/EP10.0 列出的4-氰基吡啶，2-吡啶甲酰肼均未檢出[14]。基于以上研究，并結合文獻資料對8 種已知雜質進行了來源歸屬，詳見表1。一般情況下，工藝雜質及降解雜質都須在原料中進行控制，由于制劑中工藝雜質不會增加，故只須控制降解雜質及原輔料相容性產物。在異煙肼片仿制藥一致性評價中，已知雜質中須控制的是：異煙酸、異煙酰胺、1,2-二異煙酰基肼及乳糖異煙腙。如果研究證明光降解產物1,2-二異煙酰基肼在確定的儲存條件下，并在加速試驗、長期試驗中不會增加，則在質量標準中無需單獨控制，籠統要求即可。乳糖異煙腙僅在處方中添加乳糖時產生，沒有添加時無需考慮。

異煙肼片最大服用量為900mg/天，依照ICHQ3b 中對于制劑雜質的要求，雜質報告限為0.1%，鑒定限為0.2%，質控限為0.2%[15]。企業需對檢出在0.2%以上的未知雜質進行結構確證，參考文獻資料或根據毒理實驗結果確定質控限。但對仿制藥研發而言，企業可以從提升原料質量，優化制劑生產工藝角度入手，降低該雜質含量至鑒定限以下。

2）限度的制定。對于已知雜質，如異煙酸、異煙酰胺及乳糖異煙腙，有質量標準或文獻資料的，可結合參比制劑與仿制藥穩定性試驗結果確定雜質限度。雜質對照品價格昂貴，不建議外標法測定，主張采用加校正因子的主成分自身對照HPLC 法進行定量。為確保相對保留時間定性的準確性，質量標準中可指明色譜柱型號及參數。在系統性試驗中，需要驗證雜質與主成分之間的分離度時，可采用雜質對照品的相應試劑代替。未知雜質的控制，研究者可根據穩定性試驗數據統計分析，以幫助擬定質控限度，試驗設計參照原CFDA 發布的《化學藥物（原料藥和制劑）穩定性研究技術指導原則》。

如果該雜質為仿制藥特有雜質，質控限就不得高于鑒定限，對異煙肼片來說是0.2%。若為仿制藥與參比制劑共有雜質，當參比制劑含量高于鑒定限0.2%時，質控限不得高于參比制劑含量；若參比制劑含量低于鑒定限0.2%，則仿制藥可高于參比制劑，但不得高于鑒定限。為使降解雜質符合質量標準限度，縮短有效期是被容許的，國家藥品審評中心(CDE)公布的已通過異煙肼片一致性評價的產品說明書中有效期存在12 個月，24 個月。而一致性評價之前，多數國內企業異煙肼片有效期設定均為36個月。雜質質控詳細研究思路可參考謝沐風作者的系列文章[16,17]。

2.2 溶出度

體外溶出行為的比較已成為仿制藥申報和上市后質量監管工作中越來越重要的一個關鍵質量指標。異煙肼片為可申請BE 豁免品種，需證明仿制制劑與參比制劑為BCSⅠ類快速溶出或BCSⅢ類非常快速溶出。此時，胃排空是藥物吸收的限速步驟，藥物的吸收速度和吸收程度就不會依賴于藥物的溶出時間或在胃腸道的通過時間[18]，僅取決于制劑中API 的特性[19,20]。李飛[21]認為對于高溶解性快速溶出類制劑的處方、原輔料質量及生產工藝的變化很難從溶出結果中體現，此類產品溶出方法的確定不需要更多驗證。

然而，申請生物豁免并非易事。BCSⅢ類藥物的難點在于達到仿制制劑與參比制劑處方種類用量的一致；BCSⅠ類藥物的難點在于證明其高滲透性。而滲透性數據的獲得并不容易，有些滲透性試驗的成本甚至超過了體內BE 試驗[22]。所以我們才會看到，在申報異煙肼片一致性評價時，有兩家企業放棄申請生物豁免，完成了BE 研究。

一般來說，選擇原研制劑的溶出度方法是一種比較保險的做法[23]。但是有的情況下，選擇已有溶出方法作為質量標準并不能很好反映產品的關鍵質量屬性[24]。依據“仿產品，不是仿標準”理念，還應根據仿制制劑的特點及BE 研究數據，在對參比制劑、仿制藥進行溶出曲線研究后，制定出符合本制劑質量控制的溶出度方法作為該仿制藥上市后的質量標準[25]。

筆者之前的pH-溶解度曲線測定顯示異煙肼的溶解度無pH 依賴性[26]，該曲線與X 軸基本平行，理論上同一制劑多條溶出曲線應重合。這與我們對山德士異煙肼片及國內多家企業仿制制劑在四種溶出介質中的溶出曲線測定結果一致[27]。同時，我們可以假設，若仿制制劑本身四條曲線不能重合，推測產品的處方工藝還有提升空間。在測定了20 家國內異煙肼片的溶出曲線后，結果顯示不同企業制劑在水中溶出量差異較大[26]。比較各國藥典除USP43 溶出介質為0.01mol/L 鹽酸溶液外，其余均為水。日本的“藥品品質再評價工程”將溶出度評價作為主要手段，提出“溶出一致，臨床療效一致”理念，溶出試驗條件也是各國藥典中最嚴格的[28,29]。我們有理由相信JP17 的溶出度質量標準具有更強的可參考性。溶出裝置選擇槳法，轉速為50rpm。同時，從秉承環保、提高效率出發，首選水作為溶出介質。

溶出曲線測定時，為保證不同采樣時間點溶出量測定的準確度，通常采用HPLC 法；而在質量標準擬定時，快速溶出類制劑通常為一個介質一個時間點，在排除輔料干擾的前提下，考慮UV 對照品法。溶出限度的制定可參考FDA 發布的相關指南[30]，在規定的溶出條件下，API 為高溶解性的口服固體制劑的可接受限度為30min 溶出量80%，以此作為一個最低的要求。

3 參比制劑的選擇

參比制劑是一致性評價的標桿，對體外質量評價有決定作用。參比制劑應是處方工藝合理，質量穩定的藥品。

3.1 處方組成

參考藥品說明書，山德士與梯瓦異煙肼片（100mg）添加輔料的功能基本一致，最大的不同是山德士異煙肼片處方中添加了輔料乳糖（見表3）。

表3 參比制劑輔料比較

乳糖是片劑較理想的稀釋劑，我國乳糖產量低，價格貴，較少使用。調研發現我國仿制藥異煙肼片處方中均不含乳糖。而文獻報道，乳糖可與胺類化合物配伍后生成棕黃色的加成物，在處方中含有乳糖時，可能會增加異煙肼片的生物豁免風險[31,32]。

3.2 質量分析

在雜質譜分析中，發現山德士異煙肼片中的特有雜質乳糖異煙腙，含量可高達3.1%。該雜質含量遠遠超出了ICH 中Q3b 的質控限度[15]。同時，山德士異煙肼片有關物質兩批批間差異較大，批號ME130402：異煙酸0.21%，乳糖異煙腙1.6%，異煙酰胺0.12%，各雜質總和2.0%；批號ME130036：異煙酸0.06%，乳糖異煙腙3.1%，異煙酰胺0.03%，各雜質總和3.2%[14]。

筆者采用已建立的HPLC 溶出量測定方法[27]：槳法50rpm，溶出介質為pH1.2,pH4.5,pH6.8 及水500ml，取樣時間點為5min,10min,15min,30min。測定了兩種參比制劑在四種溶出介質中的溶出曲線。結果顯示，山德士與梯瓦異煙肼片在四種介質中15min 時溶出量均達到85%以上，為非常快速溶出（如圖2 所示）。

圖2 參比制劑在四種溶出介質中的溶出曲線

同一批12 片樣品15min 溶出量RSD%，梯瓦：RSD%<2%（n=12），山德士：RSD%<4%（n=12）。梯瓦異煙肼片批內一致性更佳。

3.3 小結

從參比制劑遴選順序來說，原研產品具有全套的質量研究、體內BE 試驗及臨床有效性試驗數據，應首選FDA 進口原研制劑：山德士異煙肼片。但作為可申請生物豁免品種，在符合快速溶出或非常快速溶出時，生物不等效風險較低。在經過一系列藥學研究后，顯示山德士處方存在異煙肼與乳糖不相容的風險，有關物質中檢出含量3.1%的雜質；而梯瓦異煙肼片的處方合理，溶出均一性更佳，在結合穩定性試驗數據的基礎上，可優先考慮作為我國異煙肼片一致性評價參比制劑。

4 結語

仿制藥一致性評價研究的核心是對藥物制劑處方工藝的再研究。不論是申報仿制藥還是一致性評價，目標都是建立一個完善合理的質量保證體系[24]，保障仿制藥上市前后產品質量與參比制劑或原研制劑一致。NMPA 第102 號文指出，自首家仿制藥品種通過一致性評價后，其他生產企業的相同產品原則上3 年內要完成，在藥品集中采購方面不再選用未通過一致性評價的品種[33]。同時，“4+7 帶量采購”的實施，使通過一致性評價的仿制藥與原研產品同組競價[34,35]，促使仿制藥企業完善生產線，實現行業全面轉型升級。

近年抗結核菌藥物導致的嚴重肝損傷越來越受到人們的關注，異煙肼作為一線藥物有著不可替代的作用。在新一代抗結核藥物問世前，如何利用現代化技術，研發出能減少異煙肼造成肝損害的新型藥物制劑顯得越來越迫切[36]。中國已加入ICH，對國內藥企的研發能力將提出更高的要求，對企業來說既是機遇也是挑戰。企業在積極應對的同時，應全面做好戰略布局，應對產業升級，不斷研發創新。