大豆滯綠(stay-green)突變體誘變后代表型性狀變異分析

鄭 赟，溫宏偉，王 鵬，李貴全*

(1.山西農業大學農學院， 太谷 030801; 2.山西農業科學院小麥研究所，臨汾 041000)

滯綠(stay-green)現象[1]發生在植物衰老的過程中，葉綠素不降解或降解不明顯，特別在生育末期，葉片和果實保持綠色，甚至不完全黃化。大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.] 品種資源豐富，其中存在功能型和非功能型的兩種滯綠突變體。功能型滯綠突變體的葉片衰老機制受損，使其可以保持更長時間的光合作用及有機物的積累，對提高作物產量具有重要的研究意義。陳駿伯[2]研究發現“持綠型”小麥的葉片具有高光合活性，使制造的同化物持續大量地運輸到籽粒中，從而提高了產量；白紅丹等[3]研究科豐14大豆滯綠突變系，發現大豆滯綠突變系成熟后期莖葉和籽粒種皮色呈現綠色，葉綠素降解較慢，認為大豆滯綠突變體在產量方面有提高的潛力。非功能型滯綠突變體僅僅是葉綠素降解受到抑制，光合作用仍然隨植物衰老而下降，因此是研究葉綠素降解的理想材料?？蒲泄ぷ髡咭呀涜b別出D1、D2、cytG和G這4個位點的突變會導致大豆種子發生滯綠，D1和D2是隱形遺傳，兩個基因同時突變才能導致種子發生滯綠現象，D1為子葉滯綠基因，被定位在大豆第1條染色體上，D2為種皮滯綠基因，被定位在第11條染色體上[4]；而cytG被確定是細胞質遺傳的位點[5,6]，部分阻滯類囊體蛋白的降解；G與D1連鎖，導致種皮滯綠。

滯綠突變體研究符合如今功能農業、功能食品的時代背景，開發利用滯綠大豆可以加快我國優質特色功能大豆的研究進展，為農業的發展注入新鮮血液。為了在較短的時間獲得更多滯綠大豆的變異類型，通常采用誘變育種大幅度改變某些性狀，創造種質，擴大群體的資源庫，從中選擇適應所處地區生態環境的有利變異。研究人員試驗證明，對植物體進行輻射誘變可以產生早熟、抗病、矮稈、育性和株型突變的突變體[7-9]。同時，越來越多的科研工作者重視生態育種，作物生態育種以不同生態區域對作物品種的要求為基礎，在育種過程始終不脫離生態條件因子的影響，立足于生態指標進行育種鑒定和評選品種，品種育成后將成為適應某生態區域種植的生態型品種[10]。將輻射誘變和生態育種相結合選育適合目標性狀的品系，在國內外已經十分普及。國際上，Humphrey[11]用中子輻射處理了兩個大豆品種，獲得了適合高緯度高寒地區栽培的早熟品種。日本九州農業試驗站通過輻射誘變大豆，從中選擇出了酯氧合酶缺失的大豆突變體，即無腥味大豆，增加了大豆食用品種的選擇[12]，也為主要進行豆制品加工的大豆栽培地區提供了優質品種。在我國，從上個世紀50年代末育種家們就開始采用輻射誘變育種的方法，從大豆中培育出許多優質品種。翁秀英等[13]利用X射線和60Co誘變滿金倉和東農4號等大豆品種，經過后代的篩選，育成了黑農4、5、6、7號等多個大豆新品種(系)，其中黑農6號含油量為23.4%，且比滿金倉早熟7～10 d，系高油早熟的優質品種，符合黑龍江地區高緯度低溫的生長條件，開啟了我國大豆誘變育種與生態育種的先河。此后大豆輻射誘變技術陸續在國內開展，Yuan等[14]利用γ射線誘變大豆種子選育出了低磷含量的大豆突變體，提升了大豆的營養和食用價值，廣泛滿足各地對高產低植酸大豆的種植需求。

由于山西省內的地理和氣候條件存在較大差異，導致我省北部屬于北方春大豆區，中南部則屬于黃淮夏大豆區，為適應兩大產區的不同需求，對育種目標的要求非常高。北方春大豆區是我國大豆的主要出口基地，育種目標側重產量;黃淮夏大豆區主要用于豆制品加工，育種目標在產量的基礎上更注重品質。本實驗室于2011年在種質資源庫中發現了一種自然變異產生的大豆突變體，其種皮色和子葉色均為綠色，褐臍，灰茸毛，紫花，尖葉型，亞有限結莢習性，一般有效分枝0～2個，百粒重20.34 g左右，生育期一般在115～120 d，具有滯綠特性。利用60Co誘變該大豆滯綠突變體，對其兩年獲得的M5、M6代群體農藝性狀觀察記錄，溫宏偉等[15]在此前研究中已發現后代材料雖然并未全部繼承滯綠特性，出現了種皮色由綠到黃的過渡，在葉形、茸毛色、花色等方面表現出多樣性，且在產量、品質、適應性及生理方面也產生了豐富的變異，但是其研究僅僅是對農藝性狀進行了基礎統計處理以及簡要的描述分析，在其研究基礎上，用相關性分析、主成分分析、聚類分析對后代17個主要農藝性狀統計分析，發掘滯綠突變體后代各農藝性狀的潛在聯系以及具有潛在育種價值的株系，逐步完善對滯綠大豆突變體庫的構建，為滯綠大豆誘變后代的遺傳多樣性研究提供基礎的數據分析，為選育出符合山西省內兩個大豆產區要求的特色大豆、高品質大豆提供有價值的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的材料是大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.] 滯綠突變體Z-94320(雙青豆，來自山西農業大學大豆育種研究室)及其誘變后代M5、M6，M5有90個材料，M6有108個材料。

1.2 誘變處理及誘變后代的田間實驗設計

本試驗是于2016、2017年在山西農業大學試驗田基地和大豆遺傳育種實驗室進行的。2012年，用60Co-γ射線輻射處理滯綠突變體“Z-94320”大豆風干種子，劑量率為1.6 Gy/min，輻射劑量為120 Gy，種植收獲得到M1代，2013年種植得到M2代，在M2代中選擇優良變異單株以及特殊變異個體，經過幾年的連續選育，于2016年得到M5代90個突變體品系，到2017年獲得M6代108個突變體品系。

2016年5月9日在山西農業大學農學院大豆育種試驗田種植突變體誘變M4代種子，采用隨機區組設計，行長5 m，行距0.5 m，株距0.25 m，重復3次，常規田間管理。2017年，5月13日播種M5代，其他試驗方法與記錄同2016年一致。

1.3 數據采集及處理

成熟后，每株系隨機抽取10株進行農藝性狀室內考種，測產，并記錄大豆生育期、種皮色、子葉色和臍色?？挤N項目：株高、株重、結莢高度、莖粗、主莖節數、有效分枝數、主莖莢數、分枝莢數、一粒莢數、二粒莢數、三粒莢數、四粒莢數、癟莢數、總莢數、蟲食數、50粒重以及單株粒重。

用Microsoft Excel對統計記錄的數據進行整理，用SPSS 24.0和DPS 6.05軟件對數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 滯綠突變體誘變后代生物學性狀變化及生育期統計

滯綠突變體大豆誘變后代生物學性狀發生了很大的變異(見圖1)，誘變后群體出現圓葉、白花、褐茸毛、白臍、黑臍、黃色子葉、黃色種皮和淺綠色種皮等不同于滯綠突變體的變異類型，誘變后代的種皮色出現綠色程度不同的過渡直至變黃的株系，出現滯綠性能衰減的株系，縱觀整個滯綠大豆突變體庫，發現在這個誘變后代群體中，綠色種皮綠色子葉的株系、黃色種皮黃色子葉的株系、淺綠色種皮綠色子葉株系、淺綠色種皮黃色子葉株系的差別不大，不同種皮色和子葉色的各株系分別為28、26、29、25個，不符合一對基因或者兩對基因控制的規律。在所研究的17個農藝性狀的變異情況中，四粒莢數、癟莢數、分枝莢數、有效分枝數、蟲食數、一粒莢數、三粒莢數、二粒莢數這8個農藝性狀在M5和M6代中與CK相比，均變化較大。

圖1 衰老期滯綠突變體誘變后代的植株Fig.1 The plants of mutant progeny of stay-green mutants during the senescence(a)滯綠突變體CK;(b)普通非滯綠變異株系(a)Stay-green mutant CK;(b)Common non-stay-green mutant

由表1可知，M5生育期的變異幅度在98～138 d，M6生育期的變異幅度在95～142 d，兩代的生育期都集中在早熟(101～110 d)與中晚熟(130～140 d)之間，而其中極早熟(<100 d)和晚熟(140～150 d)都是極少數品系，極早熟品系為M5的60(98 d)，M6的60(96 d)、88(99 d)以及100(95 d)且晚熟在M5代中并不存在，只存在于M6代分離出的品系92(140 d)、101(142 d)。

表1 誘變后代生育期統計Tab.1 Statistics of the development stage of mutation progenies

2.2 滯綠突變體誘變后代表型性狀相關性分析

在M5和M6代群體的農藝性狀中，株重與莖粗、主莖莢數、分枝莢數、一粒莢數、二粒莢數、三粒莢數、癟莢數、蟲食數、單株粒重均呈現極顯著正相關(P<0.01)；株高與有效分枝數表現出顯著的負相關(P<0.05)，在M5、M6中的相關系數分別為-0.225、-0.189，因此，株高與有效分枝這兩個農藝性狀存在著相互制約的作用，株高與癟莢數和蟲食數的相關性在M5和M6代材料中表現出不同，在M5代群體中，這兩個農藝性狀沒有明顯的相關性，但是在M6代群體中，則存在著極顯著的負相關(P<0.01)，相關系數分別為-0.325、-0.271，因此，推測這個結果可能是在M6代中由于當年氣候雨水條件和在考種過程中出現的誤差導致；莖粗與主莖莢數、分枝莢數、二粒莢數、三粒莢數、癟莢數、總莢數、單株產量呈極顯著正相關(P<0.01)，表明莖粗對產量因子的影響較大，可以通過從誘變群體后代中的粗桿株系中選育出高產品系；總莢數與株重、莖粗、有效分枝數、主莖莢數、分枝莢數、一粒莢數、二粒莢數、三粒莢數、癟莢數呈極顯著正相關(P<0.01)。我們知道，株重和莖粗影響植株的營養物質積累從而影響莢數，與此結果相符；單株粒重與株重、莖粗、主莖莢數、分枝莢數、一粒莢數、二粒莢數、三粒莢數、癟莢數、蟲食數呈極顯著正相關(P<0.01)，因此在選育高產株系時，可結合這幾個農藝性狀，從而可以預測株系的優越性與否。

表2 誘變后代農藝性狀的簡單相關系數Tab.2 The simple correlation coefficients for agronomic traits of mutation progenies

2.3 滯綠突變體大豆誘變后代表型性狀主成分分析

采用降維提取主成分的方法對17個農藝性狀進行分析。如果特征值大于1，則可以提取其主成分。由表3可知，提取四個主成分，M5代中的前四個主成分貢獻率分別為38.28%、14.56%、9.375%、8.275%，累積貢獻率達到70.50%，可以代表70.50%的農藝性狀的信息；M6代中前四個主成分貢獻率分別為42.84%、11.14%、10.71%、6.835%，累積貢獻率達到71.54%，可以代表71.54%的農藝性狀的信息。

表3 主成分的初始化特征值Tab.3 The initial eigenvalues of principal component

根據表4和圖2，M5代中，第一主成分與總莢數、株重、單株粒重、分枝莢數、二粒莢數、主莖莢數、三粒莢數的權重系數較大，分別為0.982、0.934、0.909、0.867、0.809、0.726、0.663，這些農藝性狀與誘變后代群體的產量相關，因此，將第一主成分稱為“產量因子”，代表著6.509個農藝性狀，承載了38.28%的信息量；第二主成分與株高、主莖節數、結莢高度、有效分枝數的權重系數較大，分別為0.647、0.603、0.521、-0.549，這些農藝性狀與后代群體的株型有關，將第二主成分稱為“株型因子”，代表著2.476個農藝性狀，承載了14.56%的信息量；第三主成分與四粒莢數、50粒重、莖粗、結莢高度的權重相對較大，分別為-0.618、0.465、0.448、0.333，此類農藝性狀與誘變后代群體的粒莢有關，將第三主成分稱為“粒莢因子”，代表著1.594個農藝性狀，承載了9.375%的信息量；第四主成分與一粒莢數、主莖節數、結莢高度、三粒莢數權重相對較高，分別為0.607、0.584、0.438、0.419，與莖莢有關，稱為“莖莢因子”，代表著1.407個農藝性狀，承載著8.275%的信息量。

表4 誘變后代M5和M6群體農藝性狀所提取出的主成分矩陣Tab.4 The principal component matrix extracted from the agronomic traits of M5 and M6 groups

圖2 M5和M6代主成分碎石圖Fig.2 Principal component lithotripsy of M5 and M6

M6代群體中，第一主成分為“產量因子”，第二主成分中蟲食數占權重較大將其稱為“蟲害因子”，第三主成分為“株型因子”，第四主成分中主莖節數和有效分枝的權重較大，為“莖桿因子”?？赡茉贛6代中所出現的區別與2017年降雨有關，水分條件較好，植株的營養生長較旺盛，從而促進了各株系的生長。

2.4 滯綠突變體誘變后代表型性狀的聚類分析

利用DPS軟件根據滯綠突變體誘變后代的農藝性狀對各個株系聚類，采用類平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean,UPGMA)計算其歐式距離，得到圖3，將M5、M6株系分為6類。

第一類有：M5：1 (CK)、41、46、73、11、31、19、7、16、81、12、32、56、54、51、35、40、4、28、29、30、86、71、18、47、88、64、76、25、89、39、53、62、49、3、10、5、8、21、14、43、85、87、34、36、82共46個株系；M6：1 (CK)、62、17、6、7、10、20、45、37、21、46、5、23、93、80、27、108、101、22、51、14、96、29、98、32、78、104、59、99、18、19、48、86、34、55、58、50、64、94、66、71、85、28、97、3、4、52、13、81、53、60、54、67、91、103、102、44、49、33、40、73、36、39、41、43共65個株系。

第二類有：M5：2、9、24、23、27、80、6、15、79、78、37、45、26、20、63、33、67、48、65、44、70、61、38、68、13、90、42、17、66、22、50、58共32個株系；M6：2、79、16、38、69、90、56、63、76、70、87、8、57、47、24、31、105、11、15、82、30、65、84、61、72、83、26、12、100、89、92、25、95、9、42、35共36個株系。

第三類有：M5：52、60、75、84、69、77、57、59、72九個株系；M6：74一個株系。

第四類有：M5：55一個株系；M6：75、88、107、106四個株系。

第五類有：M5：83一個株系；M6：68一個株系。

第六類有：M5：74一個株系；M6：77一個株系。

圖3 滯綠突變體M5(左)、M6(右)代的農藝性狀聚類分析結果Fig.3 The cluster analysis result according to agronomic traits of M5(left) and M6(right)

表5中，M5和M6同代中各類群農藝性狀情況大致相似，但是各農藝性狀在兩代之間的變化明顯，在株重、結莢高度、單株粒重等方面M6顯著高于M5。

在M5代中，第一類群中出現了株重、株高、總莢數和單株粒重等低于CK的情況，說明該類群體屬于低產類群；第二類群在株高和結莢高度表現出較高特征，但是單株粒重等產量特征變化不突出，也屬于低產類群；第三類群、第四類群和第五類群各農藝性狀差異并不大，但在產量方面三類群間逐漸遞增，屬于中產類型；第六類群中只有74號材料，屬于M5代的高產類群，無論是在株重、莖粗，還是主莖莢數、分枝莢數、一粒莢數、二粒莢數、三粒莢數、總莢數以及50粒重、單株粒重,均表現為最優。

表5 誘變后代聚類的各類農藝性狀平均值Tab.5 The average of phenotypic characters in clustering of mutant progenies

在M6代中，第一類群中有效分枝數較少，單株粒重較低，滯綠突變體(CK)歸為這一類，這類突變體后代整體上的農藝性狀和CK區別不大，說明該類群體的材料可能沒有發生太大的基因突變，且該類群為低產類群；第二類群中，株高和四粒莢數方面表現出較高的特征，在單株粒重方面處于中間水平，因此，認定為該類群是高桿的中低產類群；第三類中只有74號材料，該株系在株重、主莖莢數、分枝莢數、二粒莢數、總莢數方面具有較高的特征，結莢高度高于對照CK，單株粒重處于較高水平，因此，認為該類株系是結莢高度較高的高產品系，可以重點關注，在大豆適應機械化生產方面具有很好的適應性；第四類群體中，主莖莢數較CK差別不大，但是分枝莢數較多，單株粒重處于較高水平，認為該類群是分枝莢數較多的高產品系，不利用機械化生產；第五類為68號材料，該株系結莢高度高，可能由于考種過程中個別材料的主莖下部結莢掉落而影響了整體的結莢高度的平均值，產量較低，屬于低產類型；第六類為77號材料一個株系，該株系的單株粒重達到110.77 g，相對于CK的14.02 g具有明顯的變異，該材料為超高產株系。

3 討論

生態育種的目標是根據不同生態區域的生態條件要求育出適應型品種，區別于傳統育種以高產、優質、抗性作為首要目標，生態育種更加強調以生態為本的重要性，云南省四家育種單位聯合利用生態育種將不同甘蔗品種在不同試點進行多年試驗觀察，對多個甘蔗品種的農藝性狀、抗逆性及抗病蟲害性和主要經濟性狀、主要工藝性狀作出了綜合評價[16]。作物育種家們利用輻射誘變技術在選育優良品種和突變系等方面已經做了大量的工作，如水稻脆性突變體[17]、輻射誘變與雜交相結合選育的龍輻麥21[18]。本研究將大豆自然突變的滯綠突變體再加以誘變，繼而從大量突變體選育適宜地方生態的優良品種，是一個創新點，對于構建大豆滯綠突變體庫具有積極價值。

滯綠突變體大豆誘變后代生物學性狀發生了很大的變異，其中滯綠性能的變化在誘變后代群體中表現最突出，不同種皮色和子葉色的各類株系的比例不符合一對基因或者兩對基因控制，因此推測大豆種皮色由三對以上基因控制，這與前人認為大豆種皮色是至少由五個基因位點控制(I、R、T、O、WI)[19]相協調，但是由于材料是誘變群體而非雜交群體后代，對大豆控制滯綠的種皮色基因應從雜交群體分離情況再加以研究認證。大豆滯綠突變體誘變后代種皮色的過渡對于進一步研究植物滯綠特性的機理及功能提供了幫助。充分利用光溫資源和保證作物安全生產是種植制度的基本要求[20]。大豆作為典型的短日照作物，各生育期的長短對其產量、品質、適應性的影響尤為關鍵，在特定生態環境下獲得適應的成熟期是最大限度提高農作物產量的潛在前提條件[21]。滯綠大豆屬于中早熟(111～120 d)品種，其誘變后代中出現了極早熟60、88、100和晚熟新品系92、101，就生育期而言，已廣泛滿足三大產區的種植要求。

通過與對照組的差異分析，誘變后代材料中在株型、莖粗、結莢高度及單株粒重等方面表現出豐富的差異性，對選育高產、適應機械化生產的大豆品種的選育提供了豐富的資源。例如，M6代中對照的結莢高度均值為14.7 cm，而M6代中則表現為從8.2～64.9 cm的變化幅度，單株粒重CK均值為15.71 g，M6代表現出從12.62～92.63 g的變幅。大豆農藝性狀屬于數量性狀，由多基因控制，所以采取對誘變后代材料進行差異性分析，農藝性狀間的相關性分析，主成分分析以及聚類分析來全面研究，從而篩選出有利于目標性狀的株系。農藝性狀很大程度上決定了大豆的產量[22]，明確農藝性狀與產量的關系，對作物新品種選育和高產栽培技術研發具有重要意義[23]。通過對農藝性狀的相關性分析得到莖粗與主莖莢數、分枝莢數、二粒莢數、三粒莢數、癟莢數、總莢數、單株產量呈極顯著正相關(P<0.01)，這與王宏勇等[24]的研究結果一致。劉明等[25]利用間作種植大豆發現了除生殖生長期外，莖粗、單株莢數、生育期等10個性狀與單株產量呈極顯著正相關，且莖粗和生育期的相關系數最高。主成分分析中將總莢數、株重、單株粒重、分枝莢數、二粒莢數、主莖莢數、三粒莢數歸為“產量因子”，從這些農藝性狀的數據上可以預測產量的情況。本研究中M5、M6提取出的主成分大致相同，但個別有差異，M5代提取了“產量因子”、“株型因子”、“粒莢因子”、“莖莢因子”，M6代提取出了“產量因子”、“蟲害因子”、“株型因子”、“莖桿因子”可能是由于農藝性狀受基因型和環境共同作用而導致出現差別。符小發等[26]對南繁大豆材料的7個產量相關性狀進行主成分分析，得出了產量性狀因子、熟期因子和分枝因子3個主成分，并從中篩選出單株粒數、單株莢數、生物產量和株高4個農藝性狀是造成大豆品種產量差異的重要因子。滿強等[27]利用主成分分析，篩選出小麥水旱地品種回交二代的綜合性狀優良的單株主要來自于大穗、多粒及高粒重的高產型類群和株高較高、穗粒數中等、穗長和千粒重優勢明顯的水旱兼用和旱肥型類群，得到了與實際大田一致選種結果，有效提高了選種效率。聚類分析結果中發現滯綠突變體在產量方面開始衰退，劃分到低產類型，而后代也出現了高產、超高產的株系，這為選育高產的滯綠特色大豆品種提供了一定的理論依據。各類群中表現突出的優良品系，必須對其進行深入的比較分析，運用多元回歸方程分析法與聚類分析相結合進行綜合評價，最終的判定將更有說服性[28]。

本研究結果表明：滯綠大豆誘變后代產生了豐富的變異，滯綠大豆本身屬于中早熟的低產品系，誘變后代出現了56號滯綠材料，且生育期為103 d，單株產量超過品種其所在類群平均水平及對照品系，基本滿足黃淮夏大豆區對優質、高產、特色大豆品種的種植需求；后代還產生了高產和超高產兩個株系，但該高產株系一般可以從莖粗的株系中進行選育，單株粒重、株重、莖粗、主莖莢數、分枝莢數、一粒莢數、二粒莢數、三粒莢數、癟莢數、蟲食數可以對產量產生影響。屬于高產品系的74號材料，在株重、莢數、單株粒重、結莢高度等方面均優于滯綠大豆，具有適應大豆機械化生產的潛力，超高產品系77號材料在產量方面產生的優良變異可以為滯綠大豆產量的改良提供參考。