GOD 在MspA 和BLM 修飾玻碳電極表面上的直接電化學和電催化研究

曹遠福

（江西有色地質勘查二隊，江西 贛州 341000）

葡萄糖氧化酶屬于氧化還原酶類。GOD 的氧化還原反應的實質是氫轉移反應，其在體內主要的生理功能是在O2存在的條件下，催化葡萄糖氧化成葡萄糖內脂的同時生成H2O2，所以，將GOD 作為生物燃料電池陽極催化劑和葡萄糖生物傳感器的研究有重要意義。但由于GOD 的氧化還原活性中心FAD 深埋在酶分子內部，通常情況下難以進行直接的電化學反應。到目前為止GOD 可以在介孔分子篩上進行直接電化學反應，在生物燃料電池中，GOD 在修飾電極上的直接電化學反應研究也較多，這也是生物燃料電池陽極催化劑的發展趨勢。

1 材料與方法

1.1 化學試劑

雙肉豆蔻磷脂酰膽堿（DMPC）(純度≥99%)，鐵氰化鉀，高純氯仿，凝蛋白度為4.09 的孔蛋白，葡萄糖氧化酶來自美國Sigma 公司。磷酸鹽緩沖溶液（PBS），無水乙醇，0.1 mol L-1葡萄糖溶液，0.05mol L-1葡萄糖溶液（北京化學試劑廠，由tris+kcl 配制，使用前在室溫條件下放置過夜），C12H10FeO4，粉末狀，配成0.02mmol/L 的FMCA 的pH=6.62 的PBS 溶液， 除非特殊提到的地方所有的水溶液均用二次水[1]。

1.2 GOD/MSPA/BLM/GC 電極的制備

制備膜液：取2mgDMPC 溶解于1ml 的氯仿中。在制備磷脂雙分子層以前，在拋光布上用Al2O3對電極進行拋光，并在5mmol/L 鐵氰化鉀溶液中進行循環伏安測量，在得到氧化還原電勢差≤160mV，才算電極磨好。并在去離子水中超聲。然后用氮氣將電極吹干，再吸取10uL 膜液滴在電極表面，待氯仿揮發后磷脂雙分子層即已形成。吸取一定量的孔蛋白溶液滴在磷脂雙分子層的表面，待電極表面干后，則固定了孔蛋白的磷脂雙分子層的電極表面形成，最后吸取一定量的葡萄糖氧化酶溶液滴在上述電極表面，等電極干后，則葡萄糖氧化酶嵌在了孔蛋白上，GOD/MSPA/BLM/GC 電極制備成功。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜表征

UV-Vis是監控蛋白質二級結構變化的強有力探針。我們分別做了純GOD溶液，GOD/MspA/BLM的紫外吸收光譜，由左圖可得：在波長377nm和446nm處，GOD的氨基酸殘基特征吸收峰、GOD活性中心FAD的特征吸收峰被分別地展現出來。由右圖可得：GOD/MSPA/BLM電極上氨基酸殘基特征吸收峰由377nm處藍移至358nm， FAD的特征吸收峰從446nm 藍移至435nm處。表征結果表明：GOD被孔蛋白固定后其空間的二級結構發生了改變。

圖1 純GOD(左)和GOD/MspA/BLM（右）的紫外吸收光譜圖

2.2 電化學表征

用K3[Fe(CN)6作為標記離子，其在玻碳電極和在玻碳電極上形成有磷脂膜的電化學響應如圖2 所示。在裸玻碳電極上出現K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]可逆氧化還原峰電流,在表面覆蓋有DMPC 膜電極上明顯降低，而且氧化峰和還原峰的電位差值ΔEp 也明顯增大，這說明[Fe(CN)6]3-到達電極表面產生電化學響應的過程在一定程度上受到阻礙，這是由于季銨鹽磷脂分子是一種致密且有序排列的、膜內通道均處于關閉狀態的結構，大量的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]不能穿過膜到達電極表面，同時這樣的結果也預示著我們已經在玻碳電極上成功的制備出磷脂雙分子層，正是磷脂膜阻礙了K3[Fe(CN)6]的電化學響應[2]。

圖2 玻碳電極在1mmol/LK3[Fe(CN)6]中的循環伏安響應

2.3 不同掃速時，GOD/MSPA-BLM/GC 電極的表征

圖3 玻碳電極在0.1mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）中不同掃速時的循環伏安圖

圖4 pH=7 時，玻碳電極的陽極峰與陰極峰電流與掃速的線性關系

由圖3 可知：隨著掃速的增加，玻碳電極的氧化峰電位與還原峰電位幾乎不移動。在掃速為20-200mV/s 范圍內，無論玻碳電極的陽極峰電流還是玻碳電極的陰極峰電流，均隨掃速線性相關(圖4)，方程分別為：Pa: y=-4.0872×10-8+7.42293×10-9x,r=0.99955: Pc: y=-6.98803×10-8-7.21284×10-9x, r=-0.99942，這表明：電極上GOD 的氧化還原反應，是一個表面控制的過程。根據Laviron 計算出速度常數(ks)為3.89 s-1，這個數值比經過打磨的SWNTP (1.7s-1)電極，電鍍陽極(1.6s-1)都高，這說明GOD/MSPA-BLM/GC 電極的直接電子轉移速率很快。

2.4 不 同pH 的PBS 溶 液 對GOD/MSPA-BLM/GC 電 極 的表征

圖5 GOD/MSPA-BLM/GC電極在不同pH值的磷酸鹽緩沖液中的循環伏安圖

圖6 E0 與pH 的線性關系

圖5 GOD/MSPA-BLM/GC 電極在掃速為200mV/s， 0.1M的PBS 中，pH 分別為2.00 (a), 4.00(b), 6.00(c), 8.00(d)和10.00(e)時的循環伏安圖。很顯然在不同pH 值的PBS 中，玻碳電極上的GOD 均能產生一對穩定的幾乎可逆的氧化還原峰，且隨著pH 值由2 到10 的遞增，其氧化、還原的峰電位均發生負移，而且GOD/MSPA-BLM/GC 電極上，GOD 的最大氧化峰電流和還原峰電流均出現在pH 值為2 的PBS 中。由圖6 可知：在pH 值2.00～10.00 的區間內標準電極電位 E0 與PBS 的pH 值呈線性相關，其斜率為-51.23mV/pH，該數值與可逆電化學反應過程的理論值（-55.87mV/pH）相接近。結果表明：葡萄糖氧化酶修飾的玻碳電極上，GOD 發生直接電化學反應的同時還包含著兩個質子和兩個電子的傳遞。

2.5 GOD/MSPA-BLM/GC 電極上GOD 催化活性研究

實驗結果證明，修飾電極上的GOD 同樣具有功能活性，測試固定酶的活性，需看其對底物的催化能力是否存在。圖7 給出了GOD/MSPA-BLM/GC 電極在氧氣飽和(a)、空氣飽和(b)、氮氣飽和(c)的0.1M PBS 中的循環伏安圖，其掃描速率為100mV/s。由圖可知：在氮氣飽和的條件下，得到的是一對清晰且對稱的氧化還原峰 (曲線c)，說明GOD/MSPA-BLM/GC 電極上的GOD 能發生近乎可逆的、直接的電化學反應。當被空氣飽和時，氧化峰消失，還原峰增大(曲線b)，說明電極上的GOD 對氧氣有催化還原的作用。被氧氣飽和，觀察到了一個巨大的還原峰(曲線a)，且a＞b，說明：氧氣濃度越高，GOD 的催化還原能力越強。

圖7 GOD/MSPA-BLM/GC 電極在氧氣飽和(a)、空氣飽和(b)、氮氣飽和(c)的0.1M PBS 中循環伏安圖

圖8 被氧氣飽和的PBS 緩沖溶液與存在4.55mM（b）的葡萄糖和存在8.33 mM（c）葡萄糖的循環伏安圖

圖9 ΔIr 與葡萄糖的線性關系圖

由圖8 可知：GOD/MSPA-BLM/GC 電極上，GOD 對底物葡萄糖的電催化作用，可通過觀察氧氣還原峰峰電位(-1.0～-0.1 V 范圍內)的變化來實現。當向氧氣飽和的PBS 中加入葡萄糖到時，GOD 對氧氣的催化還原峰電流隨葡萄糖濃度的增大而減小。在圖9 中，發現ΔIr（緩沖溶液中不存在葡萄糖與存在葡萄糖時還原峰電流的差值）只在葡萄糖濃度從0 mM 到2.0mM 范圍時，ΔIr與葡萄糖濃度線性相關，這樣狹窄的線性范圍是由于實驗過程中氧氣的消耗，氧氣分壓逐漸減小，對反應起抑制作用而引起的，當葡萄糖濃度高于2.0mM 時，ΔIr基本保持不變，展現出典型的米氏反應的特征[3,4]。

3 結語

本文使用孔蛋白作為葡萄糖氧化酶的載體。采用物理吸附法成功制備成了GOD/MSPA-BLM/GC 工作電極，運用循環伏安法研究了GOD/MSPA-BLM/GC 電極的直接電化學行為。研究表明，首先在K3[Fe(CN)6]溶液中，可以得出磷脂雙分子層已成功鋪在玻碳電極上，而且孔蛋白也已成功的嵌在磷脂雙分子層上。其次，在磷酸鹽緩沖溶液中（PBS），GOD/MSPA-BLM/GC 電極上的GOD 發生了直接的，近乎可逆的兩電子兩質子表面控制的電化學反應。