高脂飲食上調大鼠慢性炎癥水平導致勃起功能障礙發生風險增高*

馮家新 齊 濤 黃展森 李 浩 朱 佩王 博 馬 帥 陳 穎 楊文濤 陳 俊**

1. 廣西壯族自治區南寧市 廣西中醫藥大學（廣西南寧 530023）

2. 中山大學附屬第三醫院不育與性醫學科（廣東廣州 510631）

3. 廣州醫科大學附屬第三醫院泌尿外科（廣東廣州 510150）

4. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院男性科（廣西南寧 530012）

前 言

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）指的是陰莖不能達到和（或）維持足夠完成陰道內性交的勃起以獲得滿意的性生活[1]。 肥胖是一種由于長時間能量攝入與消耗失衡，導致脂肪過多積累而引起的疾病[2]。 在過去的40 年里，全球肥胖發生率大幅上升，從1975 年到2016 年，男性的肥胖率從3%上升到11%，女性的肥胖率從6%上升到15%[3]。肥胖與心血管疾病[4]、高血壓[5]、2型糖尿病[6]和高脂血癥[7]等相關，而ED 與這些疾病密切相關也已被證實[8]。據報道，肥胖男性中ED 的發生率高達79%[9]，其腹圍每增加1cm，患ED 的風險則上升3%[10]。 Besiroglu H 等人通過回顧性研究發現代謝綜合征患者比正常人罹患ED 的風險增加2.6 倍[11]。 肥胖的產生主要受飲食因素影響， 特別是高脂飲食（high-fat diet，HFD）[4]。 控制飲食和減重，在一定程度上可以恢復肥胖相關性ED （obesity-associated erectile dysfunction，OAED）患者的勃起功能[9,10,12]。

陰莖海綿體組織受氧化應激[13]、炎癥[14]和機械損傷[15]等影響，都會使血液不能充分地流向勃起組織而導致ED。 HFD 能夠誘導肥胖，導致脂肪組織自然殺傷細胞的大量積累、增殖和激活，從而導致機體處于慢性炎癥水平[16]，炎性損傷引起的內皮功能障礙并導致心血管疾病已被大量研究證實[8,17]，其中促炎因子和粘附分子的高表達導致血管內皮細胞屏障功能被破壞是引起這些疾病產生的主要因素之一[18,19]。 在OAED 大鼠中，陰莖海綿體內的炎性病變與ED 的關系研究甚少。

因此，本研究試圖通過建立HFD 大鼠模型，監測其代謝、肝臟和陰莖組織病理學等指標，用最大海綿體內壓（max intracavernous pressure，Max ICP）和 平 均 動脈壓（mean arterial pressure，MAP）的比值評價其勃起功能， 同時檢測其海綿體組織中磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、 絲氨酸/ 蘇氨酸激酶（protein kinase B，AKT）、核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥通路相關蛋白的表達情況，探討HFD 對大鼠勃起功能的影響，以期尋找治療OAED 可能的靶點，為后期深入研究打下基礎。

材料和方法

一、材料與試劑

1.實驗動物

20 只雄性SD 大鼠，10 月齡左右，體重在500-700g之間，購于中山大學實驗動物中心（SCXK [粵] 2016-0029）。 本研究所有實驗方案獲得廣東省微生物研究所實驗動物中心倫理批準（SYXK[粵]2016-0156）。

2.飼料和試劑

高脂飼料配方（豬油15%，蔗糖20%，膽固醇1.2%，酪蛋白10%，磷酸氫鈣0.6%，石粉0.4%，膽酸鈉0.2%，預混料0.4%，基礎飼料52.2%），總膽固醇（total cholesterol，TCH）（A111-1-1）、 甘 油 三 酯（triglyceride，TG）（A110-1-1）、 低密度脂蛋白 （low density lipoprotein，LDL）（A113-1-1）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）（A112-1-1）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；蘇木素（G1004）、伊紅（G1001）、Anti-IL-6 Rabbit pAb （GB11117） 購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Masson's 三 色 染 色 試 劑 （G1340）、BCA 試 劑 盒（PC0020）購自索萊寶科技有限公司；Anti-PI3K P85 Alpha Mouse mAb （60225-1-Ig）、Anti-AKT Mouse mAb（60203-2-Ig） 購自武漢三鷹生物技術有限公司；Anti-NF-kB p65 Rabbit pAb （ab16502）、Anti-TNF Alpha Rabbit pAb（ab9739）、Anti-IL-6 Rabbit pAb（ab6672）購自美國Abcam 公司；RIPA 裂解液（89901）購自賽默飛世爾科技有限公司；甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，Rabbit mAb，2118L）購自美國CST 公司。

3.主要儀器

生理試驗記錄儀(BL-420S，成都泰盟軟件有限公司)，血糖檢測儀（魚躍580），自動染色機（Gem iniAS，賽默飛世爾科技有限公司）。

二、方法

1.實驗動物分組

20 只大鼠隨機平分為2 組，對照組（n=10，喂食常規飼料）和模型組（n=10，喂食高脂飼料）。 所有大鼠均自由飲水、飲食，每周監測體重和飼料用量1 次，持續4個月。

2.HFD 模型建立和海綿體測壓

連續喂養4 個月后，禁食1 夜，第二天尾靜脈針刺取血，記錄空腹血糖值（fasting blood-glucose，FBG）。 采用3%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉固定，腹部解剖出盆神經節，電刺激盆神經節的分支海綿體神經，誘導陰莖勃起。 參照Justin D.等人的實驗[20]，用BL-420S 生理記錄儀記錄ICP 和MAP 的變化（結合本實驗所使用儀器的實際情況， 將電刺激參數設置為： 電壓5.0V， 頻率20Hz、波寬0.2ms）。而后腹主動脈取血，離心后取血清，儲存于-80℃，備用。

3.組織病理學觀察

留取并修剪肝臟和中段陰莖組織， 生理鹽水清洗并吸干多余水分，置于10%福爾馬林緩沖液中固定。其余陰莖組織先用液氮猝滅，后轉移到-80℃冰箱保存，備用。經福爾馬林固定后組織，切片，常規石蠟切片脫蠟后，按標準程序對肝臟和陰莖組織進行H＆E 染色[21]；Masson's 三色染色按說明書進行。 顯微鏡下觀察和拍攝切片。

4.免疫組織化學染色

陰莖組織石蠟切片常規方法脫蠟后， 按免疫組化標準方案進行[22]。 使用的一抗包括：Anti-IL-6 Rabbit pAb（1：500），Anti-TNF Alpha Rabbit pAb（1：500），二抗為：抗兔二抗（G1215，1:50，武漢賽維爾生物科技有限公司）。 Image-Pro Plus 6.0 軟件用于陽性顆粒的半定量分析，用積分光密度（integral optical density，IOD）表示。

5.Western blot

修剪陰莖海綿體組織，加入適量RIPA 裂解液提取組織蛋白，按BCA 試劑盒的說明檢測蛋白濃度，100℃條件下使蛋白變性。 SDS-PAGE 電泳分離蛋白質，并將其轉移到PVDF 膜上。 用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉， 一抗4℃過夜。 一抗包括：Anti-PI3K P85 A lpha Mouse mAb（1：5000），Anti-AKT Mouse mAb（1：5000），Anti-NF-kB p65 Rabbit pAb （1：1000），Anti-TNF A lpha Rabbit pAb（1：2000），Anti-IL-6 Rabbit pAb（1：2000）和GAPDH（14C10）Rabbit m Ab（1：1000），二抗包括：山羊抗兔IgG (H+L) HRP（S0001，1:5000，Affinity）、山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP（S0002，1:5000，Affinity）。 增強化學發光法顯影。Image J 軟件分析，目的蛋白與內參灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

6.統計學方法

結 果

一、HFD 大鼠代謝參數比較

兩組大鼠空腹血糖變化無明顯差異。 模型組大鼠的體重增量、TCH、TG 和LDL 等水平均高于對照組，HDL 水平則低于對照組（n=6，P＜0.05），見表1 和圖1，提示HDF 能夠導致大鼠體重和血脂水平升高。

圖1 HFD 大鼠代謝參數統計分析

二、HFD 大鼠勃起功能降低

電刺激大鼠海綿體神經后，記錄MAP 與ICP 變化趨勢（圖2A）；計算Max ICP 和MAP 的比值，對照組SD 大鼠Max ICP/MAP=0.8404±0.0346， 模型組SD 大鼠 Max ICP/MAP=0.4162 ±0.0365。 模 型 組 Max ICP/MAP 值明顯低于對照組（n=6，P＜0.001，圖2B）。以上結果提示4 個月的HFD 能夠導致大鼠勃起功能下降。

圖2 HFD 大鼠勃起功能降低

三、HFD 大鼠肝臟和陰莖組織學形態變化

經過HFD 喂養4 個月后，H&E 染色結果顯示：與對照組相比，模型組大鼠肝組織中出現大量脂滴空泡，細胞核被擠向邊緣（如圖3A 箭頭所指）；海綿體平滑肌細胞（cavernosum smooth muscle cells，CSMCs）排布 欠規則，肌纖維間隙增寬（如圖3B 箭頭a 所指），內皮細胞（endothelial cells，ECs）萎縮，連續性中斷（如圖3B 箭頭b 所指）。 Masson's 三色染色顯示海綿體組織平滑肌染成紅色，膠原纖維染成藍色。 對照組大鼠平滑肌含量豐富，膠原纖維較少；而模型組平滑肌含量較少，膠原纖維較多（圖3C）。提示4 個月的HFD 能夠導致大鼠肝臟脂肪堆積，海綿體組織出現病理學改變。

圖3 HFD 大鼠肝臟和陰莖組織學形態變化

四、HFD 大鼠陰莖促炎因子表達增多

IHC 結果顯示， 模型組TNF-α （134.10±12.49）和IL-6（127.90±10.13）的表達量較對照組TNF-α（62.71±1.98）和IL-6（68.01±2.88）明 顯 增 高（n=3，P＜0.01，圖4A，圖4B），說明HFD 促進大鼠海綿體組織中TNF-α和IL-6 表達水平升高。

圖4 HFD 大鼠陰莖炎癥因子表達水平

五、PI3K-AKT 通路在HFD 大鼠勃起功能障礙發病中可能起重要作用

Western blot 結果顯示HFD 大鼠海綿體組織中，PI3K/GAPDH（0.88±0.07）、AKT/GAPDH（1.527±0.01）、NF-κB/GAPDH（0.68±0.05）、TNF-α/GAPDH（0.53±0.02）和IL-6/GAPDH （0.14±0.01） 的表達水平， 較對照組PI3K/GAPDH（0.64±0.03）、AKT/GAPDH（1.30±0.04）、NF-κB/GAPDH（0.52±0.02）、TNF-α/GAPDH（0.25±0.07）和IL-6/GAPDH（0.090±0.002）的表達水平均明顯增高（n=3，P＜0.05，圖5A），經標準化后如圖5B。 提示HFD可能通過激活PI3K/AKT， 上調NF-κB、TNF-α 和IL-6等的表達水平，促進大鼠勃起功能障礙的發生。

圖5 PI3K-AKT 通路可能參與HFD 大鼠的勃起功能障礙的發生

討 論

本研究通過構建HFD 大鼠模型，發現與對照組相比，HFD 大鼠血脂水平顯著升高，Max ICP/MAP 值降低， 陰莖海綿體組織出現明顯的病理學改變。 PI3K、AKT、NF-κB、TNF-α 和IL-6 等蛋白在HFD 大鼠海綿體組織中的表達水平顯著高于對照組。 HFD 使陰莖海綿體組織無法得到充分的血流灌注， 從而導致大鼠勃起功能下降，可能是由于CSMCs 和ECs 出現炎性損傷所致。

長期的HFD 容易導致機體肥胖[23]。據報道，肥胖和慢性低度炎癥有關。HFD 所引發的病理生理過程中，往往伴隨著肝臟Kupffer 細胞TNF-α 和IL-6 等細胞因子的分泌增多；TNF-α 和IL-6 是脂肪細胞肥大產生的主要炎癥因子[24]。炎癥因子的大量產生可導致肥胖病人血液中TNF-α 和IL-6 水平升高[25-27]，容易引起許多疾病的發生和進展，諸如動脈粥樣硬化，糖尿病和非酒精性脂肪肝等[18,28]，而ED 被認為與這些疾病密切相關[8]。 同時TNF-α 和IL-6 在ED 患者血液中表達異常已有報道[29]，可誘導內皮細胞中的炎癥基因轉錄并抑制內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表達[30]；TNF-α 直接注入小鼠的海綿體可抑制eNOS 和神經元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）基因表達[31]。 eNOS 和nNOS 是勃起過程中的重要信號分子，其產生減少與ED 的發生相關[32]。 另外，CSMCs 和ECs 是陰莖勃起組織的重要成分，CSMCs 和ECs 出現萎縮、纖維化和凋亡等，會導致海綿體組織充血異常而引起ED[33,34]。 我們的研究發現：與對照組相比，HFD 喂養4 個月的大鼠陰莖CSMCs 排布欠規則，肌纖維間隙增寬，ECs 萎縮，連續性中斷；其肌纖維含量減少， 膠原纖維含量增加；TNF-α 和IL-6 在CSMCs 和ECs 中表達增高（P＜0.01），以上結果說明炎癥因子的過度表達可能會導致CSMCs 炎性損傷， 舒縮功能受限，和ECs 通透性增加進而加重血管炎性病變， 從而導致HFD 大鼠勃起功能下降。 該結果與Salomon 等人[35]的報道相符。

通過免疫組化實驗觀察到HFD 大鼠陰莖海綿體組織中炎癥因子水平增加后， 我們對上游潛在的炎癥相關通路進行了蛋白水平的驗證（圖5）。 PI3K 蛋白家族在增殖、凋亡和分化等多種細胞功能中發揮作用[36,37]，PI3K/AKT/NF-κB 通路在炎癥調控中起到的作用也被逐漸發現[38]。 實驗結果發現PI3K、AKT、NF-κB 在HFD大鼠海綿體組織內表達水平較對照組均增高（P＜0.05），因此我們猜測海綿體組織內TNF-α 和IL-6 等炎癥因子表達增加可能與PI3K、AKT、NF-κB 的表達增加有相關性，可能是大鼠勃起功能下降的重要原因。PI3K 能激活AKT， 促進NF-κB 抑制蛋白的磷酸化降解，使NF-κB 激活，通過核轉位，促進炎性細胞因子的表達，如：IL-1，IL-6，TNF-α 等[39]。觀察到的該現象與之前糖尿病相關性ED 中PI3K/AKT 通路的激活導致氧化應激水平升高從而引起ED 的研究相似[40]。 該部分研究結果是對陰莖炎癥改變的進一步驗證和潛在機制推測，這些機制的研究為進一步機制研究和干預靶點的選擇提供了一定的理論依據。

雖然本研究觀察到HFD 大鼠PI3K、AKT、NF-κB、TNF-α 和IL-6 等促炎因子表達水平增高可能是引起勃起功能下降的原因， 但PI3K/AKT/NF-κB 通路與很多細胞功能的調節都有關。 能否通過激活PI3K/AKT/NF-κB 通路導致海綿體組織炎癥因子的過表達， 從而引起ED；或者通過抑制PI3K/AKT/NF-κB 的激活減少海綿體組織中炎癥因子的產生， 從而改善勃起功能將是下一步需要深入研究的方向和探討的靶點。

綜上，HFD 可能是通過激活PI3K/AKT 通路，上調NF-κB 的表達，引起TNF-α 和IL-6 等炎癥因子水平增高，致使CSMCs 和ECs 出現炎性損傷，引起其結構和功能障礙，最終大鼠導致勃起功能下降。