精液凍存時間對精液質量及受孕能力的影響*

王奇玲 張欣 宗** 唐 運革 鐘愷欣 馬春 杰 陳 曦

1. 國家衛生健康委員會男性生殖與遺傳重點實驗室（廣州510600）2. 廣東省計劃生育科學技術研究所男性科；3. 廣東省計劃生育專科醫院人類精子庫

人精子低溫冷凍保存技術常規應用于人類精子庫， 主要用于供精者捐精精液及有生殖保險需要的自身精液的冷凍保存[1]。 由于冷凍過程會形成冰晶及引起滲透壓的改變，誘發氧化應激并產生過量活性氧，對精子產生氧化損傷， 引起精子功能受損以及精子核和精子DNA 受損[2]。 精液冷凍過程中產生的過多活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）引起質膜多不飽和脂肪酸減少， 使膜的液態性、 流動性及通透性發生改變，造成精子的完整性和運動性被不可逆地破壞，使其質量降低，受精率下降[3]。 為減少冷凍損傷，精液冷凍方法及冷凍保護劑的選擇至關重要。如果精液冷凍保存方法合適，精子質量不會隨著凍存時間的延長而下降。 有研究報道冷凍保存超過28 年的精子仍能生育子代[4]。國內相關研究報道較少。 隨著二孩政策的全面實施，之前通過供精人工授精生育首次生育的部分夫婦使用同一供精精液號進行再次生育。 針對相同供精者的精液，再次生育時精液冷凍保存的時間較首次生育時的精液更長。 我們匯總統計了廣東省人類精子庫部分精液使用隨訪信息， 分析供精精液不同凍存時間復蘇后的精液質量及受孕能力，現將結果報告如下。

資料與方法

一、研究資料

自再次生育政策實施以來， 本院生殖中心使用廣東省人類精子庫供精精液進行人工授精治療，共有280對人工授精夫婦使用之前首次生育時使用的供精冷凍精液進行再次生育。 截至2018 年9 月累計進行541 個周期。 匯總這些夫婦在首次生育和再次生育時所用精液的相關隨訪資料。 541 個再次生育手術周期中，有42個手術周期采用與首次生育精液相同采集日期， 其余再次生育手術周期所用精液的采集日期與首次生育精液采集日期相差在3 個月之內。

二、研究指標

精液質量采用以下3 個指標評估： 復蘇后精子濃度（106/m L）；復蘇后前向運動精子百分比（%）；復蘇后前向運動精子總數（106）。 再次生育使用精液與首次生育使用精液的不同凍存時間采用凍存時間差（再次生育與首次生育手術周期的時間差，按年計）評估；精液的受孕能力采用周期妊娠率（再次生育時使用與首次生育相同供精者精液的全部人工授精周期中， 懷孕周期數/總的周期數，%）評估。

三、研究方法

懷孕信息均由生殖中心以B 超或血HCG 檢測結果確認。 精子濃度和前向運動精子百分比的計數均按照《WHO laboratory manual for the Exam ination and Processing of human semen》（第五版）[4]進行分析。前向運動精子總數為精液量、精子濃度、前向運動精子百分比3個指標的乘積。

四、統計方法

所有數據分析用SPSS19.0 軟件完成。描述性分析再次生育所用精液較首次生育受孕精液的凍存時間差。 再次生育與首次生育手術周期的復蘇后精子濃度、 復蘇后前向運動精子百分比、 復蘇后前向運動精子總數的比較采用配對T 檢驗進行分析。 計算周期妊娠率，周期妊娠率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05 代表差異有統計學意義。

結 果

一、精液凍存時間差

541 個手術周期，再次生育精液與首次生育精液凍存時間差最小1.70 年，最大10.84 年，平均相差（5.10±2.04）年。

二、復蘇后的精液質量

再次生育與首次生育精液復蘇后各參數結果如表1 所示。 再次生育精液復蘇后精子濃度略高于首次生育精液，差異無統計學意義；前向運動精子百分比再次生育精液低于首次生育精液，差異有統計學意義；前向運動精子總數再次生育精液略低于首次生育精液，差異有統計學意義。

表1 供精再次生育精液與首次生育精液復蘇后的精液質量比較

再次生育手術周期采用的精液與首次生育手術周期采用的精液是同一天采集的，42 個周期精液復蘇后各參數結果如表2 所示。 再次生育精液與首次生育精液相比，復蘇后精子濃度、前向運動精子總數差異無統計學意義。 再次生育精液的復蘇后前向運動精子百分比低于首次生育精液，差異有統計學意義。

表2 42 個再次生育周期與首次生育周期使用同一天采集的精液復蘇后精液質量的比較

三、凍存時間與精液質量的關系

凍存時間再次生育精液復蘇后前向運動精子百分比低于首次生育精液， 再次生育精液與首次生育精液的凍存時間差與前向運動精子百分比差的相關性無統計學意義（r=0.188，P=0.233）。 隨著凍存時間的延長，精液的前向運動精子百分比有下降， 但下降的幅度與凍存時間的長短無關。

四、長時間凍存后精液的受孕能力

本研究280 對夫婦接受了541 周期的人工授精手術，其中有113 對夫婦如愿懷孕再次生育，周期妊娠率為20.9%， 與同期該生殖中心的周期妊娠率21.49%（873/4063）相比，差異無統計學意義（χ2=0.1019，P=0.7496）。

討 論

隨著輔助生殖技術成為解決人類生育難題的重要手段， 精子冷凍保存技術在人類輔助生殖技術的發展中發揮越來越重要的作用。 冷凍過程中產生過多的ROS 使人精子受到氧化損傷， 復蘇后的精子其活力和受精率通常低于新鮮精液[3]。 有研究報道，精子凍融過程中產生的過量ROS 可能導致精子頭部頂體脫落、破損、內含物丟失，阻礙精卵結合，從而影響精子的受精功能[5]。 冷凍精子的頂體穿透試驗研究結果提示冷凍保存對頂體造成損傷，但精子仍能保持活性，頂體素可能未受影響，精子仍具備正常的穿透能力[6]。 來自日本的研究報道冷凍精子和新鮮精子相比受精能力并無明顯下降[7]。 本研究結果提示，再次生育精液的周期妊娠率為20.9%，與首次生育精液（使用同期的）的周期妊娠率相比，差異無統計學意義。 精液凍存時間的延長沒有降低這些精液的受孕能力。

有研究報道， 冷凍后精子活力的下降與凍存時間有非線性的關系，冷凍6 個月后的精子，復蘇后其活力下降的趨勢基本停止，保留在一定的活力水平[8]。 這是由于精子的代謝活動適應了冷凍環境并達到新的平衡， 精子長期冷凍保存后仍具有活力。 本研究結果提示， 精液凍存時間的延長可能使復蘇后的前向運動精子百分比降低， 但這種降低對精子的受孕能力沒有顯著影響。 另一方面，這些長時間凍存的精液在保存過程中由于日常工作中其他精液的移罐、 出庫等操作可能暴露于空氣中，如果操作不規范，暴露時間過長也可能影響精液復蘇后的活力。

史雅萍等[9]匯總統計，2204 個供精人工授精周期使用的供精精液復蘇后的精液參數與周期妊娠率的關系， 研究結果提示了復蘇后精子的活力及前向運動精子總數不會影響周期妊娠率，這與精液來源于供精，精液參數已在規定范圍內有關。朱丹丹等[10]對269 個人工授精周期的統計結果表明， 處理后前向運動精子總數對人工授精結局有影響， 當前向運動精子總數低于5×106時，臨床妊娠率顯著下降。 本研究結果提示，隨著凍存時間的延長， 復蘇后的前向運動精子總數沒有顯著降低，冷凍精液的周期妊娠率沒有受到影響。

總而言之，隨著凍存時間的延長，精子庫凍存的精液其精子活力雖有降低，但不影響其臨床受孕能力。 精子庫冷凍精液的質量及使用是有保障的。