RhoA 信號通路與海綿體神經損傷性ED 的相關研究進展*

葉妙勇，趙 凡 馬 軻 周 康 呂伯東(審校)

1. 浙江中醫藥大學第二臨床醫學院（杭州310053）；2.溫嶺市第一人民醫院泌尿外科（溫嶺317500）；3. 南通大學附屬醫院泌尿外科/男科（南通226001）；4. 浙江中醫藥大學附屬第二醫院泌尿男科（杭州310005）；5. 浙江中醫藥大學泌尿男科研究所/浙江省中醫藥男科重點實驗室（杭州310053）

隨著醫學診斷技術的不斷發展， 早期前列腺癌（Prostatic cancer，PCa）的確診率不斷升高，且患者人群趨于年輕化， 研究報告顯示PCa 目前在男性惡性腫瘤發病率中高居第2 位，前列腺癌根治術（Radical prostatectomy，RP）仍是臨床治療早期PCa 的首選策略[1]。 但是，即使腔鏡手術甚至機器人輔助腔鏡手術技術得以發展，鑒于陰莖海綿體神經（Cavernous nerve，CN）的解剖位置，仍很難避免在RP 中對其造成損傷，CN 損傷會直接導致患者勃起功能（erectile function，EF）顯著下降，而恢復期則需18 個月甚至更久[2]。 目前臨床用于治療ED的一線口服藥物5 型磷酸二酯酶抑制劑（Phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE5i）總體有效率為60～70%[3]，超過1/3 的患者對于PDE5i 不敏感甚至不應答，而PDE5i 對于CNIED 的療效仍存在爭議[4,5]，RP （CN 損傷）后如何維持或改善患者的勃起給泌尿男科醫師帶來挑戰，CNIED 的發病機理及治療策略亟待進一步探索。

以往大多數針對陰莖勃起調控機理的研究將關注點落在一氧化氮（Nitric oxide，NO）介導的海綿體舒張作用[6]。 而2001 年，Chitaley K 等[7]在《Nature Medicine》雜志首次報道RhoA 信號通路對陰莖海綿體平滑肌的收縮功能起到重要調控作用，靶向抑制RhoA 信號可有利于勃起，這為ED 的治療帶來了新的思路。近年來，諸多學者在研究不同類型的ED 中均發現RhoA 信號上下游關鍵蛋白分子的變化，而其在CNIED 中的病理生理進程中同樣扮演了不容忽視的角色[8]。 故本文擬結合近幾年的相關報道， 對RhoA 信號通路與CNIED 的關系及其研究進展作一綜述。

一、CNIED 的病因

CN 屬于外周神經， 其神經纖維發自盆腔神經叢，位于腹膜后的直腸外側， 緊鄰前列腺背外側的精囊頂端， 走行于前列腺和腹側筋膜之間。 因小動靜脈伴行CN 大部分走行軌跡，故形成神經血管束（Neurovascular bundle，NVB）。 當NVB 在某些情況下受傷后，CN 失用（neuropraxia） 會導致陰莖缺氧并破壞陰莖海綿體平滑肌結構和功能[9]。

目前認為CNIED 的病因主要包括非醫源性和醫源性。 非醫源性損傷主要指骨盆骨折等外傷導致的腹部深層CN 損傷、 或具有調控CN 功能的上游中樞神經系統和脊髓出現病變以及糖尿病所致CN 病變等。而醫源性損傷是CNIED 最為常見的致病因素， 前列腺癌、膀胱癌、結直腸癌等盆腔腫瘤根治性手術過程中，牽拉、鉗夾、冷凍、離斷、切除等對CN 造成的直接或間接損傷均可造成患者術后勃起功能呈 “斷崖式”的降低，CN 受損后患者夜間快速動眼期自主勃起明顯減少甚至喪失，且在接受性刺激后勃起反應亦明顯減弱[2]；腫瘤放射性治療（radiation therapy，RT）亦會造成CN 損傷，如患者在接受前列腺癌放射治療時，早期RT 對勃起的負面影響并不顯著，但由于持續性RT 會對CN 造成慢性損傷，勃起功能會呈現出“漸退式”的下降。

二、RhoA 信號及其與NO/cGMP 間的“交互作用”

1.RhoA 與Rho 激酶

Rho 屬于G 蛋白Ras 超家族小分子單體， 其亞型主要包括RhoA、RhoB、RhoC， 三者氨基酸同源性高達80%。 但相比RhoB 和RhoC，RhoA 具有更獨特的生物學調控作用， 其可直接介導肌球蛋白磷酸酶活性并參與平滑肌的收縮[10]，此外，RhoA 還參與調節細胞形態、骨架、分化及基因轉錄等。 RhoA 是小分子GTP 結合蛋白之一， 可介導GTP 活性， 與其他GTP 酶作用相似。RhoA 蛋白的活化與鳥嘌呤核苷酸交換因子（RhoGEF）、GTPase 活化蛋白 （GAP） 及鳥嘌呤核苷酸抑制因子（RhoGDI）三者存在著密切的關聯[6]。細胞質內RhoA 蛋白與GDP 結合時處于非活化狀態，與GTP 結合后可于細胞膜活化。 非活化狀態下，RhoGDI 與RhoA-GDP 結合形成穩定的復合體，并將該復合體“錨定”位于細胞質；而RhoGEF 則有助于RhoA 脫離GDP 和RhoGDI，繼而轉移到細胞膜上與GTP 結合形成活化的RhoA-GTP 復合體。RhoA-GTP 復合體進而激活下游的Rho 激酶，啟動RhoA/Rho 激酶途徑。

Rho 激酶（Rho-associated kinase，ROCK）分子量約為160kDa，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，1996 年被證實為小分子RhoA-GTP 的重要下游因子[10]。 ROCK 是目前功能研究最為詳細的RhoA 下游靶向分子， 包括ROCK-1（ROKβ） 和ROCK-2 （ROKα） 兩種亞型，ROCK-1 和ROCK-2 在體內器官組織中具有表達差異性，在細胞中發揮的作用也不盡相同[11]。 平滑肌組織中RhoA 活化后進而激活ROCK， 促進MLCP 磷酸化后介導了平滑肌收縮[6]，目前認為RhoA/ROCK 信號是防治CNIED 的潛在靶點。

2.RhoA 與NO/cGMP 信號的“交互作用”

Chitaley 等[7]于2001 年在大鼠中首次證實了RhoA/Rho 激酶信號通路與陰莖海綿體平滑肌收縮作用有關， 提出其對勃起的抑制作用獨立于NO 信號。 RhoA信號通過Ca2+增敏途徑調節陰莖海綿體平滑肌處于收縮狀態，Ca2+介導肌球蛋白輕鏈激酶的活化后可進而激活ROCK。

但是后續的研究表明NO 與RhoA/Rho 激酶通路之間存在著復雜的“交互作用（cross talk）”。 NO 在陰莖勃起中主要介導CCSMCs 及血管舒張， 由一氧化氮合酶（NOS）合成。 NOS 包括3 種同型二聚體：內皮源型（eNOS）、 神經源型 （nNOS） 及誘導型 （iNOS），經NO/cGMP/PKG 通路參與陰莖勃起反應。 而RhoA/Rho激酶對NO 信號存在負性調控，主要通過抑制eNOS 表達使NO 表達減弱。 M ing 等[12]對人臍靜脈內皮細胞過表達RhoA 后抑制了eNOS 磷酸化，同時降低其mRNA穩定性，抑制了NO 合成。 Bivalacqua 等[13]在鏈脲菌素（STZ） 誘導的糖尿病ED 大鼠中轉染抑制RhoA 表達的相關腺病毒， 證實RhoA/Rho 激酶通路調控eNOS，降低陰莖海綿體中NOS 活性與cGMP 水平。 另一方面，NO 對RhoA/Rho 激酶信號的調控具有 “兩面性”，有學者在大鼠血管平滑肌細胞中使用8- 溴-cGMP 和硝普鈉激活PKG， 導致RhoA 在Ser188 位點磷酸化后轉為失活狀態[14]， 說明NO 亦具有抑制RhoA 信號作用；而也有報道稱，當大鼠動脈中NO 被L-NAME 抑制時RhoA 蛋白和mRNA 表達均減少，相反，當予以硝普鈉時RhoA 蛋白和mRNA 表達均增加[15]。 針對NO 與RhoA/Rho 激酶信號之間的復雜互作關系，有學者運用我國傳統醫學理論的“陰陽學說”結合二者分別調控陰莖海綿體平滑肌舒張和收縮的作用進行了描述， 認為NO 信號類似于“陽”，促進了勃起；而RhoA 信號類似于“陰”，抑制了勃起，其之間存在著“陰陽”的“對立制約”或“此消彼長”，但在某些情況下又會呈現出“相互轉化”會“互根互用”[16]。 筆者認為這種描述既形象，又很好地概括了兩種信號的關系。

三、RhoA 信號在CNIED 中的研究進展

1.RhoA/ROCK 與陰莖海綿體組織

為明確兩種Rho 激酶亞型與ED 的關系，Pieter等[17]首次開展了臨床研究，該團隊收集了21 例不同病因所致重度ED 患者（均對PDE5 抑制劑不應答，擬行陰莖假體植入術）的陰莖海綿體組織，進而與5 例勃起功能正常的志愿者（前列腺腺瘤患者，因急性尿潴留擬經尿道剜除腺瘤） 的陰莖海綿體組織進行檢測分析及對比，免疫組織化學檢測圖像顯示ROCK 與α- 平滑肌肌動蛋白在組織中定位吻合， 確認了ROCK 在人海綿體平滑肌細胞中的表達， 兩組海綿體組織中ROCK-1 mRNA 表達無明顯差異（P＞0.05），而ROCK-2 的相對表達量在重度ED 組顯著提高 （7570±3013 vs 2924±432；P＜0.05），故推測ROCK-2 特異性抑制劑可能對上述難治型ED 的治療更有效。但是該研究局限性在于臨床中獲取海綿體組織樣本難度較大、且標本數量有限，因此該研究僅使用qPCR 檢測了ROCK mRNA， 而無法進一步檢測其蛋白含量， 所測得的數據亦無法就ROCK 壓型與CNIED 的關系予以分析。

利用動物構建CNIED 病理模型是目前用來研究其發病機制及潛在治療策略的主流方法，大鼠CN 可被精確地定位、分離，并對其人為造成匹配實驗所需的各種類型或程度的損傷， 故諸多學者即利用大鼠CNIED模型對Rho 激酶亞型與CNIED 相關性進行探索[18]。 早期研究表明ROCK-2 表達升高在CNIED 病理生理機制中起主要作用， 但是后續亦有研究證實ROCK-1 的高表達與CN 損傷性ED 密切相關[19-24]目前， 對于ROCK-1 與ROCK-2 在介導CNIED 發病機制方面存在爭鳴 （具有代表性的研究報告見文末表格圖）。 如Gratzke 等[19]使用5 號手術鑷在距離盆神經節（Major pelvic ganglion，MPG）2 ～3mm 處對大鼠雙側CN 施行夾損，參數為15 秒/次、共計3 次，以期造成中度的CN損傷，14 天后檢測發現，陰莖組織和背神經中nNOS 蛋白表達顯著下降， 且RhoA 和ROCK-2 蛋白表達增加（P＜0.05）， 而ROCK-1 表 達 變 化 不 顯 著（P＞0.05）。Gratzke 等[19]認為CN 損傷后RhoA 信號激活介導了ROCK2 蛋白過表達，進而對陰莖血流動力學造成負面影響， 而RhoA/ROCK2 信號的強表達可能是CN 損傷后陰莖組織缺氧及活性氧含量升高介導的。 不同的是，Cho 等[20]通過兩種方式構建CN 損傷大鼠模型，一種是在距MPG5mm 處利用顯微外科血管夾進行夾損，參數設置為30s(+)—30s(-)—30s(+)；另一種則是在距MPG 5mm 處直接離斷CN。 分別于術后1 周和8 周進行檢測， 結果顯示術后兩種模型大鼠陰莖海綿體組織中平滑肌/膠原含量比均明顯下降，1 周時夾損和離斷組大鼠海綿體中RhoA 蛋白表達均顯著升高，但僅離斷組大鼠海綿體中ROCK-1 蛋白顯著升高；術后8 周時，兩種模型海綿體組織中RhoA/ROCK-1 信號均明顯增強。該團隊認為CN 損傷所致海綿體纖維化上調了RhoA/ROCK-1 信號。 另外值得說明的是，筆者發現該團隊主要專注于CN 損傷后RhoA/ROCK-1 信號的變化，雖然在另外一篇報道中該團隊在研究局限性中指出未測ROCK-2，但縱觀其相關研究筆者暫未發現ROCK-2 研究數據。 因此，Cho 等的研究僅表明在其團隊夾損參數設置下可以造成大鼠海綿體中RhoA/ROCK-1 信號增強，但不能排除ROCK-2 表達升高的情況。

綜上，結合筆者團隊的研究，現認為CN 損傷可以介導大鼠海綿體組織中RhoA 信號增強，且其下游分子ROCK-1 和ROCK-2 均會過表達。筆者考慮實驗過程中CN 損傷動物模型構建方法的差異、 實施實驗者的操作、實驗觀察周期等不同設置均可能導致結果的差異，然而生物體的復雜性亦對上述不同的結局帶來了必然性。 筆者認為在規范化的操作步驟下，設置不同的CN損傷方式、 不同的實驗觀察點， 可有助于更好地評估ROCK 亞型在CNIED 的動態變化。

表1 ROCK 亞型與CNIED 的代表性研究（注：“↑”表示顯著增加，“-”表示無明顯變化）

2.RhoA/ROCK 與CN 損傷修復

PDE5i 是目前臨床治療ED 的一線口服藥物，但其主要作用于陰莖海綿體平滑肌細胞發揮作用， 且目前PDE5i 對CNIED 的療效仍存在爭議。 筆者認為，CNIED 的治療不能局限于陰莖本身， 亦應針對如何促進CNI 的修復予以探索。 現已有研究表明RhoA 信號的增強卻會抑制周圍神經再生[25-27]。

RT 對CN 造成的慢性損傷中存在ROCK 的表達持續增強，Mahmood 等[28]對大鼠的前列腺區域采用25Gy 劑量照射后，9 周與14 周后解剖獲取MPG，檢測發現其中RhoA 與ROCK-1 的蛋白和mRNA 表達上調，而ROCK-2 變化不明顯。Hannan 等[26]在研究中發現CN 損傷造成MPG 中RhoA/ROCK 通路活化， 繼而促進了凋亡及氮能神經功能失常（nitrergic dysfunction），而ROCK-1 抑制劑（Y-27632）可有效抑制MPG 中nNOS陽性軸突的caspase-3 依賴性凋亡、nNOS 解偶聯，抑制ROCK-1 后促進了離體培養MPG 神經突的再生，維持了氮能神經介導的勃起及陰莖海綿體的舒張。 因此，Hannan 等認為ROCK-1 可作為保護軸突對陰莖的自主神經支配治療靶點。

此外， 筆者團隊認為CNIED 的致病之源乃CN 損傷，CN 損傷屬于周圍神經損傷， 從中醫學角度而言存在“氣虛血瘀”的基本病機，因此主張以益氣活血為基本治法[29]。 而在進一步的實驗研究中，我們也證實益氣活血方藥在促進CN 損傷修復 （數據未發表） 及抑制RhoA/ROCK2 信號[30]方面可起到顯著的作用，這與中藥促進周圍神經再生的性能是相符合的[31]。

3.中醫藥對RhoA/ROCK 的調控作用

筆者所在團隊目前的學術方向之一及CNIED 的發病機理及中醫藥防治研究， 目前已經取得了一些進展，我們發現益氣活血類方藥可以有效改善CNIED，同時， 也顯示出對CN 損傷后大鼠海綿體組織中RhoA/ROCK-2 信號的抑制作用[30]。 實際上，鑒于中藥及復方的多靶點、多效應特點，已有諸多學者報道中藥制劑對RhoA/ROCK 信號的調控作用。 如宋純東等[32]研究發現，菟絲子、生黃芪、積雪草、生地黃、水蛭及大黃組成的益腎活血復方可以顯著下調糖尿病腎病大鼠腎臟組織中RhoA 及ROCK1 表達；廖山嬰等[33]研究證實復方斑蝥膠囊可降低N- 甲基-N’- 硝基- 亞甲基胍誘導的大鼠腺胃癌發病率， 而其作用機理可能為抑制RhoA/ROCK 信號通路。

總之，筆者認為在思考CNIED 的防治策略以及篩選RhoA/ROCK 信號抑制劑的過程中，我們應該充分利用自己的特有資源，在對CNIED 中醫發病機理進行思考的同時，結合現代生物學技術、計算機網絡藥理學技術等對中醫中藥這個偉大的寶庫深入地挖掘。

四、小結

自Chitaley 等于2001 年首次報道ROCK 抑制劑（Y-27632）對大鼠海綿體平滑肌張力的調節作用以來，RhoA 信號在勃起功能中的調控受到了諸多學者的關注。 實際上，ROCK 抑制劑（法舒地爾）在臨床中已被用于治療心血管疾病，但因其處于相對上游的通路位點，作用靶點廣泛，故限制了其運用于ED 的治療。 一項關于ROCK 特異性相對較高的抑制劑（SAR407899）治療CNIED 的臨床試驗2 期已于2011 年結束，但其結果并沒有公布，具體原因不清。 但是就目前的研究來看，以RhoA/ROCK 信號作為切入點研發治療CNIED 的相關藥物是具有潛力的。

同時，筆者認為在探索CNIED 的防治策略時不可僅把目光集中于陰莖海綿體。實際上，CNIED 的發病因素是確切的，非醫源性或醫源性因素下造成的CN 損傷是導致此類ED 發生發展的根源，因此，在關注“陰莖康復”問題的同時亦應注重CN 損傷的修復問題，結合前文所述，ROCK 抑制劑在促進外周神經再生方面亦可有所作為。 此外，還有研究表明，ROCK 抑制劑能夠延緩免疫缺陷小鼠中人類前列腺癌細胞的轉移[34]，筆者設想對于RP 后患者而言，ROCK 抑制劑的運用也許不僅可改善其勃起功能、促進CN 修復，還能抑制前列腺腫瘤復發，若進一步研究能予以證實，那么這種治療策略對于RP 后ED 患者可謂是“一石三鳥”。

筆者所在課題組對CNIED 的中醫藥防治策略也十分關注，基于CNIED 發病過程中CN 受損、陰莖缺氧、海綿體纖維化等特征性病理生理環節， 認為CNIED 的基本病機是“氣虛血瘀”，因此，運用益氣活血類方藥對CNIED 進行干預研究。 研究中，我們發現益氣活血方藥可明顯改善CNIED 大鼠的勃起功能，且具有抗海綿體缺氧及纖維化作用，同時，益氣活血方藥可以顯著地抑制CNIED 大鼠海綿體內RhoA/ROCK2 信號，雖然其中的機制還待進一步探索， 但是我們認為益氣活血方藥起效的部分作用機理可能與下調RhoA 和ROCK2 蛋白水平有關。綜上，以RhoA 信號為切入點，結合中西醫優勢共同探索CNIED 的治療策略應該是具有前景的。