電針對血管性癡呆大鼠腦白質纖維和學習記憶功能的效果

張冰雪，楊敏光，李建鴻，陶靜,,3，梁勝祥，柳維林，陳立典,,3

1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州市 350122；2.福建中醫藥大學康復醫療技術國家地方聯合工程研究中心，福建福州市 350122；3.福建省康復技術協同中心，福建福州市 350122

血管性癡呆(vascular dementia,VD)又稱血管性認知功能障礙，是指由腦血管病變引起的中樞神經系統功能障礙等一系列癥狀。我國65 歲以上人群中，1.1%～3.0%被診斷為癡呆，其中VD 占0.9%[1-2]。VD已成為僅次于阿爾茨海默病的第二大老年性癡呆疾病[3]，給家庭和社會帶來巨大的影響和負擔。

腦血管病變包括腦白質損傷、腔隙性梗死和微出血，其中腦白質損傷是造成VD 的重要原因[4]。磁共振彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是在體研究白質的有效工具，主要通過彌散各向異性分數(fractional anisotrophy,FA)等指標，量化觀察白質纖維束的完整性[5]，實現可視化研究VD 腦白質損傷[6]。VD患者認知功能障礙與腦白質改變相關[7]，腦白質彌漫性病變甚至早于臨床癥狀出現[8-9]。

針刺在VD治療中應用廣泛。電針可有效增強VD患者的學習和記憶能力[10-11]；針刺可明顯改善VD模型大鼠總體認知功能[12-13]。皮質下VD患者腦缺血側白質纖維FA 降低[14]；VD 患者全腦平均FA 較正常人低[15]。電針干預后，模型大鼠腦缺血灶中心和邊緣FA 增加[16]。本課題組前期研究證實，電針百會、神庭能影響癡呆大鼠腦結構，治療認知功能障礙[17-19]。本研究利用DTI 觀察電針百會、神庭前后白質纖維情況，以探討電針治療VD可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley 大鼠，購于上海斯萊克實驗動物公司，生產許可證號SCXK(滬)2014-0002，體質量(280±30) g。于福建中醫藥大學SPF 級實驗動物中心分籠喂養，許可證號SYXK(閩)2014-001。全部動物實驗倫理均通過動物管理委員會審批，并嚴格遵從國際動物保護法規施行。

1.2 儀器和試劑

戊巴比妥鈉(CQ6125000)：SIGMA 公司。動物用青霉素鈉：山東魯抗。異氟烷(R510-22)：RWD 公司。小動物磁共振成像儀(MiniMR-60 MRI system 7.0 T)：德國BRUKER 公司。SDZ-V 型電針儀、華佗牌毫針(直徑0.25 mm、長13 mm)：蘇州醫療用品廠有限公司。

1.3 模型與分組

將大鼠分為造模組和假手術組(n=8)。造模組參照Huang 等[20]的方法造模。大鼠術前禁食24 h，隨后稱重。大鼠用2%戊巴比妥鈉2 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥置于專用手術保溫墊上，四肢用醫用膠帶粘附固定，不可粘貼過緊，以免出現四肢末端缺血損傷。75%酒精于鎖骨上緣至頜下約5×3.5 cm 區域消毒，剔毛備皮。鑷子夾起頸部皮膚，沿正中線切開，從左側胸骨舌骨肌、胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌交叉點向下分離，找到左頸總動脈，顯微鑷小心分離頸總動脈與迷走神經，在頸總動脈與迷走神經間穿一條不可吸收的外科縫合線，結扎左頸動脈。5 min 后同法分離并結扎右頸總動脈。假手術組僅分離雙側頸總動脈，不進行結扎。清潔創口，縫合皮膚。腹腔注射動物用青霉素鈉溶液0.5 ml/kg。大鼠置于盛有木屑的托盤內，26 ℃左右室溫，自然蘇醒，回籠飼養。

術后12 d 對大鼠行新物體識別試驗[23]。與假手術組相比，造模組中新物體偏愛系數降低的大鼠視為造模成功。納入模型大鼠24只，隨機數字表法分為模型組(n=8)、非穴組(n=8)和電針組(n=8)。

1.4 干預方法

術后14 d，電針組參照方劍喬等[21]的定位方法取百會、神庭行電針干預，疏密波，頻率1/20 Hz，刺激強度1 mA。每天固定時間干預1次，持續30 min。

非穴組取雙側腋下非經非穴點[22]，同法電針干預。

模型組和假手術組同等條件抓取。

1.5 新物體識別試驗

造模后12 d (干預前)和40 d (干預前)，于上午9:00～12:00 對大鼠進行測試。在特殊材料制成的80×80×60 cm 無頂敞箱內，放置不易被大鼠推倒的罐子作為識別物體，分為A、B 兩組。A 組為兩個完全相同物體(A、a)，B 組是一個與A 物體大小相似的物體(B)，且大鼠在生活環境中從未見過。敞箱上方固定光源和攝像機，使用Super Maze動物行為學視頻分析系統追蹤大鼠的活動軌跡，記錄其在敞箱內活動和與物體接觸的情況。實驗過程中保持敞箱和光源的位置不變，實驗過程中保持安靜。實驗為適應、學習、測試3個階段，持續3 d。

適應階段：將實驗大鼠放于沒有任何物體的敞箱中自由探索10 min。學習階段：適應24 h 后，在箱內同側兩個角落分別放置物體A 和a，將大鼠背朝物體放入敞箱，自由探索10 min。測試階段：學習后1 h和24 h，將大鼠熟悉的物體a 換成新物體B，大鼠背對物體放入敞箱，自由探索5 min。

每只大鼠測試前，將敞箱和物體用75%酒精擦拭，以祛除上一只大鼠的氣味殘留。

判別標準：大鼠用鼻子、胡須、前肢觸碰探索物體，或鼻子、胡須與識別物體間的間隔≤2 cm 記為識別行為；趴在物體上向四周探索或在物體旁轉身、下蹲均記為識別行為。大鼠在測試階段探索物體A、B的時間記為T1、T2，偏愛系數β=T2/(T1+T2)×100%。學習后1 h和24 h的偏愛系數記為β1和β2。

1.6 DTI

干預前后，大鼠行DTI 掃描。大鼠3%異氟烷誘導麻醉5 min，100 μg/ml 鹽酸美托嘧啶0.5 ml/kg 下肢肌肉注射深度麻醉，俯臥位置于磁共振掃描床上，頭部戴專用表面線圈，牙桿和雙側耳桿固定。水循環加熱系統維持大鼠體溫相對恒定，SurgiVet V3395TPR生理檢測儀(美國SMITHS MEDICAL 公司)實時監測大鼠體溫、呼吸和心率。掃描參數：TE 32.25 ms，TR 12000 ms，FOV 32×32 mm，Segment 4，Averages 1，Image Size 128×128，Slices 48，b01000 s/mm2，Slice Thickness 0.56 mm，no slice gap。

1.7 統計學分析

采用SPSS 23.0 統計軟件進行統計分析。所有數據用()表示，經檢驗符合正態分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。顯著性水平α=0.05。

采用FSL(http://fmrib.ox.ac.uk/fsl)和spmratIHEP[24]軟件分析DTI 數據。數據行渦流矯正；手動顱骨剝離得到全腦掩膜圖像，計算各動物b0像和全腦FA 像；將b0像配準到大鼠標準腦模板，保留變換函數，實現FA 像向大鼠標準腦膜版的空間標準化[25]；采用3 倍體素平滑核平滑；基于一般線性模型，采用方差分析，對平滑后數據進行統計分析，P＜0.005、團簇＞10為有顯著性差異。

2 結果

2.1 新物體識別試驗

干預前，與假手術組相比，模型組、電針組和非穴組β1和β2均下降(P＜0.05)，后三組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

干預后，與模型組相比，電針組β1和β2均升高(P＜0.05)。見表2。

表1 干預前各組新物體偏愛系數的比較(%)

表2 干預后各組新物體偏愛系數比較(%)

2.2 DTI

干預前，與假手術組相比，模型組胼胝體、扣帶回、海馬、外囊白質纖維FA 降低(圖1)。干預后，與模型組相比，非穴組海馬白質纖維FA增加(圖2)，電針組海馬、扣帶回、胼胝體、外囊白質纖維FA增加(圖3)；與非穴組相比，電針組海馬、胼胝體、外囊白質纖維FA 增加(圖4)。

3 討論

VD 屬中醫“呆病”，基本病機為本虛標實，病位在腦但涉及臟腑。多因氣血虧虛，加之內傷勞倦，引起陰陽失調；髓海不足，陽氣衰虛；痰濁瘀阻，神機失用，遂為癡呆[26-27]。督脈陽氣虛衰所致臟腑功能低下是癡呆病主要原因之一[28]。百會、神庭為督脈要穴，百脈之會，神志所在，是上行之氣聚集處。針刺百會、神庭可通行氣血、升陽舉陷、開竅醒腦，治療癡呆等神志病變。

針刺療法能有效治療VD 所致的認知功能障礙[29-30]。馬莉等[31]綜述近10 年針刺治療VD 的相關報道，顯示針刺法療效優于一般藥物組或常規治療組。邵瑛等[32]電針百會等穴，明顯改善VD 模型大鼠學習記憶能力。江一靜等[33]針刺百會、神庭，提高非癡呆型血管性認知障礙患者的認知能力。本研究顯示，電針百會、神庭能增加認知相關腦區白質纖維FA，有效改善VD大鼠學習記憶能力。

圖1 模型組與假手術組FA差異圖

圖2 非穴組與模型組FA差異圖

圖3 電針組與模型組FA差異圖

圖4 電針組與非穴組FA差異圖

新物體識別試驗可檢測大鼠的總體認知功能。先讓動物熟知兩個物體，隨后將其中一個換成新物體，動物本能將探尋新物體，較少探尋熟知物體。通過比較對新物體的探尋時間占整個探尋時間的比例判斷大鼠的記憶能力。若大鼠對新舊物體的探尋指數無差異，表明大鼠存在記憶障礙。VD 模型小鼠新物體識別試驗顯示顯著的學習和記憶障礙，治療后新物體辨別指數和辨別系數提高[34]。本研究顯示，電針百會、神庭能提高VD大鼠的記憶能力。

白質主要由有髓纖維和膠質細胞組成，連接各皮質，負責神經元間信號傳遞，對學習、記憶有重要影響[35]，腦白質損傷可引起不同程度認知功能下降[35]。VD 患者的認知功能障礙與腦白質損傷相關[36]。特定位置白質結構完整性與特定認知障礙有關，癡呆患者前額葉、海馬等腦區白質纖維受損，導致認知功能障礙[37]。

FA 能量化評價腦白質纖維損傷。VD 患者腦缺血側白質纖維FA 降低，主要集中于雙側前額葉、扣帶回、海馬和下額枕束區[8,14]。電針后白質纖維見不同程度重構[38]。本研究顯示，VD 模型大鼠電針干預后，白質纖維改變主要存在于胼胝體、扣帶回、外囊等腦區，集中在前額葉皮質、海馬等重要部位，提示電針能夠修復認知功能相關腦區白質纖維損傷。

綜上所述，電針百會、神庭可修復VD 大鼠白質纖維束損傷，特別是與學習記憶相關的前額葉、海馬等腦區，白質的恢復與認知功能恢復相關。電針非穴和特定穴位對不同腦區白質纖維及認知障礙的影響仍需進一步研究。