RP-HPLC 法同時測定九味羌活丸、片、顆粒中4 種成分

劉 斌曾隆勇周思敏

（1.德陽市食品藥品安全檢驗檢測中心，四川 德陽618000； 2.德陽市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 德陽618000； 3.德陽廣播電視大學(xué)，四川 德陽618000）

九味羌活方出自金代名醫(yī)張元素，后來元代醫(yī)家王好古師從張元素之徒李杲，首次將九味羌活湯錄于《此事難知》 中［1］，具有疏風(fēng)解表、散寒除濕之功效，用于外感風(fēng)寒挾濕所致的感冒，再經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)制成九味羌活丸、九味羌活顆粒［2］、九味羌活片［3］，三者均由羌活、防風(fēng)、蒼術(shù)、細辛、川芎、白芷、黃芩、地黃、甘草9 味藥材組成。方中君藥羌活味辛、苦，性溫，功效散表寒、祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、止痹痛，為治太陽風(fēng)寒濕邪在表之要藥，其主要活性成分為羌活醇、阿魏酸、異歐前胡素、紫花前胡苷等［4-7］；臣藥防風(fēng)味辛、甘，性溫，功效祛風(fēng)除濕、散寒止痛，主要成分有異歐前胡素、紫花前胡苷等［8］；佐藥白芷功效祛風(fēng)散寒、宣痹止痛，主要成分有異歐前胡素、紫花前胡苷等［9］，而川芎功效祛風(fēng)止痛，為止頭痛之要藥，主要成分有阿魏酸等［10］。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，尚無同時測定該系列制劑中以上成分含有量的報道［11-15］，故本實驗建立RP-HPLC 法同時測定九味羌活丸、片、顆粒中羌活醇、阿魏酸、異歐前胡素、紫花前胡苷的含有量，以期為相關(guān)質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

Waters e2695 高效液相色譜儀［沃特世科技（上海）有限公司］；XS205 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ-700DV 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。羌活醇（批號111820-201705，純度99.9%）、阿魏酸（批號110773-201614，純度99.0%）、異歐前胡素（批號110827-201812，純度99.6%）、紫花前胡苷（批號111821-201604，純度99.6%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。九味羌活丸、片、顆粒均為市售，由6 個廠家（A～F）生產(chǎn)，共8 批。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1 色譜條件 TechMate C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～15 min，25%～38% A；15～17 min，38%A；17～45 min，38%～50% A；45～55 min，50%～75% A；55～55.1 min，75%～95%A；55.1～60 min，95% A；60～60.1 min，95%～25% A；60.1～70 min，25% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長317 nm；進樣量10 μL；記錄時間70 min。理論塔板數(shù)按羌活醇峰計，應(yīng)不低于2 000。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品羌活醇0.015 90 g、阿魏酸0.010 08 g、異歐前胡素0.014 78 g，置于100 mL 量瓶中；紫花前胡苷0.020 62 g，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，各精密量取1 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得（每1 mL 分別含羌活醇31.768 2 μg、阿魏酸19.958 4 μg、異歐前胡素29.441 8 μg、紫花前胡苷82.150 1 μg）。

2.3 供試品溶液制備 取3 種制劑，研細混勻，各精密稱取0.5 g，置于具塞三角瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（350 W、40 kHz）處理40 min，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 根據(jù)處方分別制備缺羌活、白芷、防風(fēng)、川芎、羌活＋白芷＋防風(fēng)＋川芎的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備，即得

2.5 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品在對照品相應(yīng)位置上存在相同保留時間的色譜峰，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項下貯備液1 mL，置于5、10、20、25、50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得羌活醇、阿魏酸、異歐前胡素、紫花前胡苷方程分別為Y＝21 826.821 2X＋17 641.363 6（r＝0.999 8）、Y＝51 071.935 0X＋21 624.317 4（r＝0.999 8）、Y＝27 442.650 6X＋26 314.915 3（r＝0.999 7）、Y＝17 690.999 6X＋42 036.225 6（r＝0.999 7），分別在2.944 2～31.768 2、1.995 8～19.958 4、2.944 2～29.441 8、8.215 0～82.150 1 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 定量限、檢出限 對照品溶液用甲醇逐級稀釋，分別以S／N＝3、S／N＝10 為檢出限、定量限。結(jié)果，羌活醇、阿魏酸、異歐前胡素、紫花前胡苷檢出限分別為 101.658 2、7.983、23.55、16.43 ng／mL，定量限分別為181.714 1、19.160 1、82.436 9、46.004 0 ng／mL。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取3 種制劑，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、4、8、12、16、20、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得羌活醇、阿魏酸、異歐前胡素、紫花前胡苷峰面積RSD 分別為0.4%、0.6%、0.4%、0.4%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，每次10 μL，測得羌活醇、阿魏酸、異歐前胡素、紫花前胡苷峰面積RSD 分別為0.3%、0.2%、0.2%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.10 重復(fù)性試驗 取同一批制劑，平行稱定6份，每份0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得羌活醇、阿魏酸、異歐前胡素、紫花前胡苷峰面積RSD 分別為0.4%、0.5%、0.2%、2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗 精密吸取羌活醇對照品溶液（158.841 μg／mL）1.38 mL、阿魏酸對照品溶液（99.792 μg／mL）0.65 mL、異歐前胡素對照品溶液（147.208 8 μg／mL）1.39 mL、紫花前胡苷對照品溶液（410.750 4 μg／mL）1.37 mL，各6份，置于150 mL 具塞錐形瓶中，溫水浴揮干甲醇。精密稱取含有量已知的水丸（含羌活醇0.438 3 mg／g、阿魏酸0.128 8 mg／g、異歐前胡素0.409 3 mg／g、紫花前胡苷1.377 4 mg／g）0.25 g，各6 份，置于具塞錐形瓶中，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.12 樣品含有量測定 取3 種制劑，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長選擇 本實驗采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)紫花前胡苷在334.3 nm、阿魏酸在217.8、235.5、322.3 nm，羌活醇在249.7、310.4 nm，異歐前胡素在 249.7、310.4 nm處有最大吸收。由于九味羌活中羌活醇含有量很低，而紫花前胡苷相對較高，故最終確定317 nm作為檢測波長。

3.2 色譜條件選擇 本實驗考察了流動相甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、乙腈-冰醋酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-水分離效果最好，優(yōu)選比例后，最終確定乙腈-0.1%冰醋酸作為流動相。另外，由于中成藥組成復(fù)雜，等度洗脫無法進行有效分離，故選擇梯度洗脫。

3.3 提取方法選擇 前期查閱文獻發(fā)現(xiàn)，羌活醇、異歐前胡素轉(zhuǎn)移程度分別在45、55 ℃下最大［16］，而阿魏酸對光、熱敏感，尤其見光易分解［17］，故選擇避光超聲提取。然后，考察了提取溶劑25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、乙醇，以及提取時間30、40、50 min 對提取效率的影響。最終確定甲醇避光超聲提取40 min 作為提取方法。

3.4 含有量分析 不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的九味羌活制劑中各成分總含有量差異明顯，均以羌活醇最低（尤其是顆粒劑），表明需進一步加強對羌活原藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。另外，羌活為九味羌活制劑君藥，而羌活醇為該藥材特征性、活性成分［4-7］，其含有量是否會明顯影響制劑療效尚不明確［18］，有待繼續(xù)研究。