輔色劑對紫淮山花色苷穩(wěn)定性的影響及其熱降解動力學研究

張錦鈺，鄭棉文，王 鋒*，李清明，蘇小軍,2，郭時印，鄧朝陽，唐蘭芳，譚興和

(1.湖南農業(yè)大學食品科學技術學院， 長沙 410128； 2.湖南省作物種質創(chuàng)新與資源利用重點實驗室， 長沙 410128)

現榨飲料是指以新鮮水果、蔬菜或谷類、豆類等雜糧為原料，現場制作的供消費者直接飲用的非定型包裝飲品。隨著人們健康意識的提高，現榨飲料受到越來越多的關注，現榨飲料行業(yè)作為餐飲業(yè)配套行業(yè)之一，也得到了迅速發(fā)展[1]。紫淮山營養(yǎng)物質豐富，鮮嫩多汁，且具有抗氧化、免疫調節(jié)、降血糖血脂等保健功效[2]，是現榨飲料良好的原料來源。由鮮嫩的紫淮山制成的現榨飲料，色澤艷麗，口感潤滑，已成為很多餐飲店的招牌飲料，深受消費者喜愛。不過，新鮮幼嫩的紫淮山收獲期較短，且不耐貯藏，使現榨飲料的原料來源受到限制。將紫淮山以漿液的形式保存起來，是解決這一問題的關鍵。然而，紫淮山因含有豐富的花色苷[3]，其漿液容易受到pH、光照、溫度、金屬離子、氧化還原劑等因素的影響[4]，出現降解、褪色、品質下降等現象。輔色劑可通過向花色苷溶液提供大量π電子，阻止水分子及親核試劑對花色苷分子的攻擊，增強花色苷穩(wěn)定性[5]。檸檬酸、蘋果酸、槲皮素、黃芩素、咖啡酸等均是果汁中常用的輔色劑[6-8]。不過相比于現榨水果飲料，現榨紫淮山飲料比較特殊，帶有酸味和苦澀味物質的添加會使其口感變差，接受度降低。

谷胱甘肽(glutathione,GSH)和沒食子酸(gallic acid,GA)不僅具有抗氧化、解毒、提高免疫力等功能，對花色苷色素也有輔色作用。Wu等[9]發(fā)現谷胱甘肽可以抑制葡萄汁中的酶促褐變和非酶褐變，增強花色苷的穩(wěn)定性。Roidoung等[9]將沒食子酸添加到蔓越莓汁中，發(fā)現蔓越莓花色苷的保留率提高。在我們前期的試驗中發(fā)現，添加少量谷胱甘肽和沒食子酸對現榨紫淮山飲料的口感幾乎沒有影響。本研究擬以谷胱甘肽和沒食子酸作為輔色劑，探討其對紫淮山花色苷降解率和顏色值的影響，并研究紫淮山花色苷在不同溫度下的熱降解動力學，得出熱降解動力學方程，以期為紫淮山花色苷的輔色及提高紫淮山漿液的保藏穩(wěn)定性提供理論基礎與實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫淮山(DioscoreaalataL.)，采自湖南新邵縣紫玉農業(yè)科技有限公司生產基地。

谷胱甘肽、沒食子酸購于上海瑞永生物科技有限公司；鹽酸、冰醋酸、無水乙酸鈉、氯化鉀均為國產分析純。

1.1.2 儀器設備

PL03電子天平購于梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計購于上海美普達儀器有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機購于德國Eppendorf儀器公司；電熱恒溫水浴鍋購于北京市永光明醫(yī)療儀器廠；PHS-3C型PH計購于上海今邁儀器儀表有限公司；恒溫培養(yǎng)箱購于上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫淮山色素液的制備

將新鮮無腐爛、大小均勻的紫淮山洗凈、去皮、切分成均勻大小，按固液比1∶2加入蒸餾水打漿，避光浸提1 h(20 ℃)，4 500 r/min離心10 min，得到上清液即為紫淮山色素液，4 ℃冷藏保存，備用。

1.2.2 花色苷含量測定

采用pH示差法測定紫淮山花色苷含量[11]。取紫淮山色素液2 mL，分別用pH 1.0緩沖液和pH 4.5緩沖液定容至10 mL，室溫放置20 min后，用紫外分光光度計掃描紫淮山色素液在450～700 nm波長范圍內的吸光值，確定最高吸收峰的波長為510 nm，分別檢測波長為510 nm和700 nm處吸光值A。花色苷含量按下列公式計算：

(1)

A=(Aλ510-Aλ700)pH1.0-(Aλ510-Aλ700)pH4.5

(2)

式中：MW為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量449.2(g/mol)；DF為稀釋因子；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數26 900；1為光程(cm)。

1.2.3 輔色劑對紫淮山花色苷降解率的影響研究

取適量紫淮山色素液，分別加入不同質量分數的谷胱甘肽和沒食子酸，然后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保存，以未添加輔色劑的為對照組(control check,CK)。每3 d測定一次花色苷的含量，共測6次，并計算第15天時花色苷的降解率。為消除微生物的影響，向每組待測樣品中加入1%疊氮鈉溶液10 μL。花色苷降解率計算公式如下：

花色苷降解率/%=

(3)

1.2.4 紫淮山花色苷熱降解動力學分析

取適量紫淮山色素液，加入質量分數分別為0.03%的谷胱甘肽和0.2%的沒食子酸，并設置空白為對照組(CK)。將三組紫淮山色素液分別放置于50、70、90 ℃恒溫水浴鍋中加熱，定時測定花色苷含量，記錄數據。采用動力學一級反應規(guī)律分析紫淮山花色苷降解過程[12,13]，按下式計算一級反應速度常數(k)、半衰期(t1/2)、活化能(Ea)和溫度系數(Q10)：

ln(Ct/C0)=-kt

(4)

t1/2=ln0.5×k-1

(5)

lnk=lnk0-Ea/RT

(6)

Q10=(k2/k1)10/(t2-t1)

(7)

式中：C0為初始時刻花色苷含量(mg/L)；Ct為一定溫度下加熱t(yī)后花色苷含量(mg/L)；k為降解速率常數(min-1)；t為處理時間(h)；k0為頻率常數；R為氣體常數(8.314×10-3kJ/mol·K)；T為絕對溫度(K)；k1為t1℃時的速率常數；k2為t2℃時的速率常數。

1.2.5 輔色劑對紫淮山花色苷色差影響研究

取適量紫淮山色素液，分別添加0.03%的谷胱甘肽和0.2%的沒食子酸，并設置空白為對照組(CK)。將三組紫淮山色素液置于50 ℃恒溫水浴鍋加熱，每隔4 h測定一次花色苷含量和色素液的亮度L*、紅值a*和黃值b*，分析谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山色素液熱穩(wěn)定性的影響。顏色值參數(a*、b*、L*)計算參照文獻[14]。

τ=10-A

(8)

X=19.717τ450 nm+1.884τ520 nm+42.539τ570 nm

+32.474τ630 nm-1.841

(9)

Y=7.950τ450 nm+34.764τ520 nm+42.736τ570 nm

+15.759τ630 nm-1.180

(10)

Z=103.518τ450 nm+4.190τ520 nm+0.251τ570 nm

+1.831τ630 nm+0.818

(11)

L*=116(Y/Y0)1/3-16

(12)

a*=500[(X/X0)1/3-(Y/Y0)1/3]

(13)

b*=200[(Y/Y0)1/3-(Z/Z0)1/3]

(14)

式中：A為吸光度；Τ為透光率；X、Y和Z是根據國際光學委員會推薦的公式計算200～700 nm波長范圍內的紅、綠、黃三原色刺激值；X0、Y0、Z0是CIE (Commission International de L’Eclairage)推薦的標準白光的顏色三刺激值，X0=94.825，Y0=100，Z0=107.381。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示，數據采用Origin 8.5、Excel 2010、SPSS 19.0等軟件進行分析，以P<0.05表示試驗結果具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山花色苷降解率的影響

圖1 谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山花色苷含量隨時間變化的影響Fig.1 The effects of glutathione and gallic acid on the content changes of purple yam anthocyanin over time

圖2 谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山花色苷降解率的影響Fig.2 Effects of glutathione and gallic acid on the degradation rate of purple yam anthocyanin 注：同一處理組小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters in the same processing group indicates significant difference (P<0.05)

谷胱甘肽和沒食子酸都是重要的抗氧化劑，與花色苷共存時，可抑制花色苷的降解[15,16]。如圖1、2所示，在25 ℃條件下，紫淮山花色苷含量隨著時間的增加而減少，添加谷胱甘肽和沒食子酸的紫淮山花色苷含量明顯高于對照組。當谷胱甘肽和沒食子酸的添加量分別為0.03%和0.2%時，紫淮山花色苷的降解率分別為55.05%和60.07%，均低于對照組的74.52%，這一結果表明谷胱甘肽和沒食子酸可以有效抑制紫淮山花色苷的降解。同時，谷胱甘肽和沒食子酸的添加量越大，花色苷的降解率越小，不過質量分數為0.03%、0.04%和0.05%的谷胱甘肽對花色苷降解的抑制作用無顯著性差異(P<0.05)；質量分數為0.2%、0.3%和0.4%的沒食子酸試驗組，花色苷的降解率也無顯著差異，原因可能是谷胱甘肽添加量為0.03%時，紫淮山花色苷溶液基本完全輔色；沒食子酸添加量為0.2%時，花色苷分子也與其基本完全結合，故繼續(xù)添加谷胱甘肽或沒食子酸對花色苷降解的抑制作用無顯著增加。從節(jié)約資源方面考慮，選擇0.03%谷胱甘肽和0.2%沒食子酸進行后續(xù)試驗。

2.2 紫淮山花色苷熱降解動力學解析

由圖3和表1可知，加入0.03%谷胱甘肽和0.2%沒食子酸后，紫淮山花色苷在不同溫度條件下的熱降解皆符合一級降解反應動力學(R2>0.90)。觀察花色苷降解速率常數(k)可知，隨著溫度的升高，試驗組和對照組的k值均增大，花色苷的降解反應加快，不過，經谷胱甘肽和沒食子酸輔色后的花色苷k值均顯著低于對照組，半衰期(t1/2)和活化能(Ea)均顯著高于對照組(P<0.05)，如在70 ℃條件下，對照組花色苷的半衰期為18.53 h，谷胱甘肽和沒食子酸組的半衰期分別為38.29 h和26.35 h，是對照組的2.07倍和1.42倍。活化能代表物質在發(fā)生轉變時需要越過能壘，能壘越高則物質的穩(wěn)定性越高[17]，在本試驗中對照組的活化能Ea為47.73 kJ/moL，明顯低于谷胱甘肽組的60.71 kJ/moL和沒食子酸組的53.48 kJ/moL，這一結果說明谷胱甘肽和沒食子酸均能夠增強紫淮山花色苷的熱穩(wěn)定性。Q10為溫度系數，其值越大，表示熱降解反應速率對溫度變化越敏感，在50～70 ℃范圍內，谷胱甘肽和沒食子酸組的Q10均小于對照組，說明在低溫條件下，添加谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山花色苷降解的抑制作用較好。但在90 ℃時，輔色劑對紫淮山花色苷的輔色效果不明顯，張麗霞等[18]在研究藍莓花色苷時有同樣的現象出現，這可能是由于花色苷受熱后其結構發(fā)生轉變，導致生色結構2-苯并吡喃鹽和醌式假堿減少。

圖3 紫淮山花色苷降解動力學分析Fig.3 Kinetics analysis of purple yam anthocyanin (a)對照組;(b)0.03% GSH組;(c)0.2% GA組(a)CK;(b)0.03% GSH processing group;(c)0.2% GA processing group

表1 紫淮山花色苷在50～90 ℃熱處理條件下的熱降解動力學參數Tab.1 Kinetic parameters of purple yam anthocyanin degradation at 50～90 ℃

2.3 輔色劑對紫淮山花色苷色差的影響

圖4 谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山花色苷溶液L*的影響Fig.4 Effects of glutathione and gallic acid on L*of purple yam anthocyanin solution

L*表示紫淮山色素液的明亮程度，其值越大表明溶液顏色越透亮。從圖4可以看出，隨著加熱時間的增加，紫淮山花色苷溶液的亮度L*值呈逐漸增大的趨勢，且對照組>0.2%沒食子酸組>0.03%谷胱甘肽組，如在50 ℃水浴中保溫20 h后，L*值分別上升了37.88%、33.32%、28.14%。加熱會促進花色苷的降解，導致溶液顏色變淺、亮度增大，因此，上述結果也間接反映了花色苷的降解程度，且0.2%沒食子酸和0.03%谷胱甘肽對花色苷的降解有一定的抑制作用。

圖5 谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山花色苷溶液a*的影響Fig.5 Effects of glutathione and gallic acid on a*of purple yam anthocyanin solution

a*代表紫淮山色素液的紅值，值越大，溶液越偏向紅色。加熱會促使紫淮山花色苷的結構發(fā)生變化，使其由紅色的黃烊鹽陽離子式向藍色醌型堿式轉變[19]，從而導致花色苷溶液由紫紅色變?yōu)樗{綠色，紅值a*減小。如圖5所示，隨著加熱時間的增加，紫淮山花色苷溶液的a*值呈逐漸降低的趨勢，如在50 ℃水浴中保溫20 h后，對照組、0.2%沒食子酸組、0.03%谷胱甘肽組的a*值分別降低了44.70%、27.38%和24.95%，不過對照組a*值下降速度明顯高于其他兩組，說明沒食子酸和谷胱甘肽對紫淮山花色苷具有輔色效應。

圖6 谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山花色苷溶液b*的影響Fig.6 Effects of glutathione and gallic acid on b* of purple yam anthocyanin solution

b*代表紫淮山色素液的黃值，值越大，溶液越偏向黃色。在加熱條件下，花色苷會發(fā)生氧化、酶促褐變、抗壞血酸降解等化學反應[20]，使黃褐色物質積累，黃值b*增大。如圖6所示，隨著加熱時間的增加，對照組紫淮山花色苷溶液的b*值呈逐漸增大的趨勢，不過0.2%沒食子酸組和0.03%谷胱甘肽組的b*值增幅較小，變化不明顯，這說明沒食子酸和谷胱甘肽能夠改善花色苷的品質，抑制氧化和褐變反應的發(fā)生。

3 討論

本試驗表明，谷胱甘肽和沒食子酸對紫淮山花色苷均有較好的輔色作用，且兩者最佳添加量分別為0.03%和0.2%，在此添加量條件下，室溫放置15 d后的紫淮山花色苷降解率分別為55.05%和60.07%，顯著低于對照組的74.52%。添加谷胱甘肽和沒食子酸后，紫淮山花色苷溶液的亮度(L*)、紅值(a*)、黃值(b*)相比對照組變化較小，花色苷的品質也得到了較好的保留。谷胱甘肽結構中含有一個活潑的疏基硫原子，其極化形成的空d軌道重疊后親核作用增強，在加成反應中的速度超過-NH，率先與羰基化合物加成[21]，這可能是其抑制花色苷褐變，增強花色苷穩(wěn)定性的原理。沒食子酸是一類無毒、易被人體吸收的天然多酚類物質，其苯環(huán)上的三羥基基團具有較高的還原能力和較低的O-H鍵斷裂焓[16]，因此，沒食子酸有較強的抗氧化作用，與花色苷共存時，兩者能以氫鍵和范德華力作用結合，形成水平或垂直重疊的穩(wěn)定復合物[4]，從而使花色苷呈色增強。

紫淮山花色苷在50、70、90 ℃下的熱降解皆符合一級降解反應動力學規(guī)律；添加谷胱甘肽和沒食子酸的花色苷溶液的k值均小于對照組，活化能Ea卻比對照組的46.46 kJ/mol分別提高了13.10 kJ/mol和5.69 kJ/mol；同時，70 ℃時，谷胱甘肽和沒食子酸組的半衰期分別是對照組的2.07倍和1.42倍，這說明谷胱甘肽和沒食子酸能夠增強花色苷的熱穩(wěn)定性。隨著溫度的升高，對照組和試驗組的紫淮山花色苷降解速率均加快，這與蘇帆等[22]所發(fā)現的酚酸對紅肉蘋果花色苷的輔色作用隨著溫度的升高而減弱的結果相一致。Jasmina[23]研究發(fā)現輔色劑與花色苷分子間的反應是一個放熱過程，高溫會促使兩者分解。因此，即使在添加輔色劑的條件下，仍應盡量于低溫環(huán)境中貯藏紫淮山漿液，以保持其顏色的穩(wěn)定性。

谷胱甘肽和沒食子酸具有抑制紫淮山花色苷降解、增強花色苷熱穩(wěn)定性以及延緩花色苷顏色值變化的作用，將谷胱甘肽和沒食子酸作為紫淮山花色苷的輔色劑，可有效改善花色苷在保存期的穩(wěn)定性并延長紫淮山漿液的保藏期。而谷胱甘肽和沒食子酸復合劑對紫淮山花色苷的協同輔色效果如何，兩者輔色的機理如何還有待進一步研究。