γ-CGTase酶學性質及產物特異性影響因素

鄭丹妮，柏玉香，紀杭燕，李曉曉，王禹，蔣彤，金征宇*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

環糊精葡萄糖基轉移酶(cyclodextrin glycosyltransferase, CGTase)是一種多功能型酶，能催化4種不同的反應：3種轉糖基反應(歧化反應、環化反應和偶合反應)和水解反應。現階段，歧化、偶合反應主要用于制備甜菊糖苷[1]、葡萄糖苷[2]、L-抗壞血酸[3]，環化活力主要應用于生產環糊精(cyclodextrin, CD)。根據反應初期產物中主要CD的類型[4]，將CGTase分為α-CGTase、β-CGTase、γ-CGTase。由于γ-CGTase的主產物γ-CD存在分子空腔大、溶解性好及安全性高的獨特優勢，以及在小腸中γ-CD可被淀粉酶作用后降解吸收而α-CD、β-CD不能被降解[5]，使得γ-CD在醫藥、食品、材料、環境、化妝品等領域有著特殊應用[6-9]。因此，γ-CGTase作為γ-CD生產中的關鍵酶制劑，對其進行篩選、改造及其生產γ-CD工藝條件的優化一直是研究熱點。

γ-CGTase作用淀粉或其衍生物的產物為α-CD、β-CD、γ-CD的混合物，只在特定反應階段中單一CD含量較高。目前已報道的γ-CGTase共有8種，來源于Bacillussp. G-825-6[10]的γ-CGTase產物中γ-CD占總CD比例高且不產生α-CD，但淀粉轉化率極低；來源于Bacillusclarkii7364[11]的γ-CGTase產物中γ-CD比例高，但體系中存在的α-CD因溶解度高給γ-CD實際純化帶來不便。為此，國內外研究者在改變產物特異性方面進行了相關研究。王磊[12]在來源于Bacillusclarkii7364的γ-CGTase作用淀粉反應體系中，加入5%(m/V)環十二酮來提高γ-CD產率；王寧[13]也利用同樣的γ-CGTase，在反應體系中添加2%(m/V)甘草酸改變γ-CGTase產物比例；李林林[14]以Bacillussp. G-825-6 γ-CGTase為基礎，通過將211位酪氨酸突變為亮氨酸來改變產物特異性，產物專一性提高了40.94%。

總體而言，國內外現有的γ-CGTase菌株較少，且γ-CGTase產物特異性較差。為此，本研究將γ-CGTase共有保守區域及特有氨基酸作為判斷指標，在美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數據庫中，通過序列比對及生物信息學分析，篩選出一種新型基因，并將其克隆表達后得到γ-CGTase；通過反應時間、淀粉質量濃度及乙醇濃度來改變γ-CGTase產物特異性，以期提供一種新型γ-CGTase以及為改變γ-CGTase產物特異性提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

α-CD、β-CD、γ-CD,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；可溶性淀粉，國藥集團化學試劑有限公司；溴甲酚綠，上海麥克林生化科技有限公司；BCA試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；蛋白上樣緩沖液，上海生工生物工程股份有限公司；預染蛋白分子量標準，南京生興生物技術有限公司；乙腈，美國TEDIA有限公司。化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

蛋白電泳系統、凝膠成像系統，中國天能有限公司；超聲波清洗器，上海聲譜超聲設備廠；高速冷凍離心機5804R，艾本德國貿易有限公司；酶標儀，美國Molecular Devices公司；超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；pH計，Mettler Toledo公司；電子天平，Mettler Toledo公司；高效液相色譜，日本島津公司；Milli-Q-超純水制備儀，默克有限公司；超高效液相色譜-質譜聯用，美國waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因挖掘及序列分析

在NCBI數據庫中，以目前報道的γ-CGTase為模板，進行序列相似性比較，選擇比對結果中相似度在30% ～ 90%的序列進一步分析。以6個保守區域、3個關鍵氨基酸為CGTase的基本判斷指標，-3亞位點47位氨基酸Thr、-3亞位點序列HP_G(E)GF_、-7亞位點 (145-152) D-----I區域為γ-CGTase特征鑒定依據，最終篩選得到來自于Bacillussp. FJAT-44876的一段基因序列。利用MEGA6軟件的Muscle模式和現有α-、β-、γ-CGTase進行序列比對，并繪制γ-CGTase保守區域及關鍵序列比對圖。

1.2.2 酶的克隆表達

在北京華大基因公司合成來自于Bacillussp. FJAT-44876的基因序列(NCBI登錄號：WP 096185680)，以pET-15b為載體，轉至E.coliBL21(DE3)進行表達。將E.coliBL21(DE3)置于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB肉湯培養基中，在37 ℃、200 r/min條件下搖床培養直至OD600達到0.4～0.6。隨后，加入終濃度為40 μmol/L的IPTG進行誘導表達，于18 ℃、160 r/min條件下培養24 h。在4 ℃、10 000 r/min的條件下離心8 min獲得菌體，隨后用20 mmol/L Tris-HCl (250 mmol/L NaCl, pH 7.5)溶液洗滌2次并采用上述條件離心。將離心后的菌體置于冰水混合物中超聲破碎20 min，最終4 ℃、10 000 r/min的條件下離心30 min獲得粗酶液。

1.2.3 酶的分離純化

首先利用去離子水和20 mmol/L Tris-HCl (250 mmol/L NaCl, pH 7.5)對鎳親和凝膠進行清洗和平衡，上樣粗酶液，重力流穿后再依次利用含不同摩爾濃度咪唑溶液的20 mmol/L Tris-HCl (250 mmol/L NaCl, pH 7.5)進行洗脫，并收集洗脫液，最后對鎳親和凝膠進行平衡及保存，以上操作均在冰水浴條件下進行。隨后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定酶分子量和Bradford法測定酶濃度。

1.2.4 酶活力測定方法

參考FUWA[15]溴甲酚綠 (BCG)法并稍作改進，對上述步驟制得CGTase的環化活力進行測定。將900 μL 15 mg/mL可溶性淀粉和100 μL CGTase在50 ℃、pH 10.0條件下保溫10 min，沸水浴10 min滅酶，再向上述體系中加入50 μL 1 mol/L HCl，100 μL 5 mol/L BCG以及2 mL 0.2 mol/L檸檬酸緩沖液 (pH 4.2)，將反應混合物在室溫下放置20 min后于630 nm處測定吸光值，其中空白不添加酶液。

酶活力單位定義為：每分鐘生成1 mg γ-CD所需加酶量為1個酶活力單位 (U)。

1.2.5 γ-CGTase最適溫度測定

將900 μL 15 mg/mL可溶性淀粉和100 μL (0.09 U) γ-CGTase混合，分別將反應溫度設置在30～70 ℃范圍內，間隔10 ℃，在pH 10.0條件下保溫10 min，沸水浴10 min滅酶，測定不同溫度下γ-CGTase酶活力。將最大酶活力者定義為100%，計算相對酶活力。以溫度為橫坐標，相對酶活力為縱坐標繪制溫度-相對酶活力曲線。

1.2.6 γ-CGTase最適pH測定

配制20 mmol/L pH 3.0～12.0的緩沖溶液(pH 3.0～5.0醋酸鹽緩沖液，6.0～8.0磷酸鹽緩沖液，8.5～12.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，使用該緩沖溶液配制不同pH下的15 mg/mL可溶性淀粉，取900 μL上述可溶性淀粉與100 μL (0.09 U) γ-CGTase混合，在50 ℃下保溫10 min，沸水浴10 min滅酶，測定不同pH下γ-CGTase酶活。將最大酶活力者定義為100%，計算相對酶活力。以pH為橫坐標，相對酶活力為縱坐標繪制pH-相對酶活力曲線。

1.2.7 動力學參數測定

以1、2、5、7.5、10、15、18、20 mg/mL不同質量濃度的可溶性淀粉作底物，在最適溫度50 ℃、最適pH 10.0的條件下反應，測定酶學動力學參數。

1.2.8 有機溶劑對γ-CGTase酶活影響

將最終體積分數為1%的甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、環己烷、十二醇加入到γ-CGTase中，4 ℃條件下放置1 h，測定不同有機溶劑作用下殘余酶活力，將未添加有機溶劑的γ-CGTase酶活力定義為100%。

1.2.9 不同反應時間對γ-CGTase產物特異性影響

將15 mg/mL可溶性淀粉和γ-CGTase (5.23 U/g干基淀粉) 按比例混合，在pH 10.0、50 ℃的條件下保溫2、4、6、8、10、15、20、30、40、50、60、90、120、150、180、240、300、360、420 min，利用HPLC測定不同時間下產物的生成。

1.2.10 不同淀粉濃度對γ-CGTase產物特異性影響

將10、15、30、50、70、100 mg/mL可溶性淀粉和γ-CGTase (5.23 U/g干基淀粉) 按比例混合，在pH 10.0、50 ℃的條件下反應6 h，利用HPLC測定最終產物。

1.2.11 不同乙醇體積分數數對γ-CGTase產物特異性的影響

以50 mg/mL可溶性淀粉為底物，添加γ-CGTase (5.23 U/g干基淀粉) 和最終體積分數為1%、1.5%、3%、5%、7%、10%的乙醇，在最適溫度50 ℃、最適pH 10.0的條件下反應6 h，利用HPLC測定最終產物。

1.2.12 高效液相色譜(HPLC)法測定

參考JI[16]的方法并稍作修改。HPLC色譜條件為：XBridge Amide (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 分析柱；流動相為V(乙腈)∶V(水)=65∶35；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL。

1.2.13 超高效液相色譜-質譜聯用(UPLC-MS)測定

UPLC使用條件為：Waters-Acquity UPLC色譜儀；BEH Aminde (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)分析柱；流動相為純乙腈(A液)，0.1%氨水(B液)；洗脫條件為75% A液與25% B液平衡5 min后洗脫15 min，65% A液與35% B液洗脫15 min，50% A液與50% B液洗脫15 min，最終使用100% A液保存柱子；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量1 μL。MS使用條件：ESI-離子方式；毛細管電壓3.0 V；離子源溫度100 ℃；碰撞能量6 V；質譜范圍(m/z)100～3 000。

1.2.14 數據處理方法

實驗結果為3次數據的平均值，以其標準偏差表示誤差線，利用Origin軟件進行數據分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 γ-CGTase生物信息學分析

采用MEGA6軟件將NCBI數據庫中Bacillussp. FJAT-44876的蛋白序列與已知表達α-CD、β-CD和γ-CD的CGTase序列進行比對，結果如圖1-A所示。來源于Bacillussp. FJAT-44876的蛋白序列共有5個結構域(數據未體現)[17]、6個保守區域、3個關鍵氨基酸，保守區Ⅲ、Ⅴ的Asp和保守區Ⅳ的Glu是 CGTase參與催化的保守殘基[18]，其中保守區Ⅲ的Asp為親核基團，可作為穩定中間體，保守區Ⅳ的Glu 為可能的質子供體，保守區Ⅴ的Asp為底物結合位點。研究表明，CGTase在-3、-7亞位點特有氨基酸的差異將導致產物特異性不同[19]，來源于Bacillussp. FJAT-44876的蛋白序列與已知CGTase特有序列比對結果如圖1-B所示。-3亞位點47位氨基酸是區分α-、β-、γ-CGTase的關鍵位點，來源于Bacillussp. FJAT-44876的蛋白序列在該位點存在γ-CGTase特有氨基酸Thr，而α-、β-CGTase在相應位點主要為Lys或Arg，表明47位氨基酸在CGTase產物特異性中扮演著重要角色[20]，同時，相比于α-、β-CGTase，γ-CGTase為具備更多空間結合糖基鏈以形成CD8，在-3亞位點存在序列HP_G(E)GF_，而α-、β-CGTase擁有序列INYSGVN(N)[21]。此外，為了擁有更大的空間，γ-CGTase在-7亞位點(145-152)缺失6個氨基酸形成D------I區域，以便促使γ-CD環的形成，而α-、β-CGTase分別為SSTDPSFA、SSDQPSFA。將基因序列與NCBI數據庫序列進行BLAST比較，發現該序列與已知的γ-CGTase：Bacillussp. G-825-6和Bacillusclarki7364相似度均為70%，依據生物信息學分析結果，初步判斷克隆表達的酶為γ-CGTase。

圖1 γ-CGTase保守區域及關鍵序列分析

2.2 重組蛋白質的分離純化

利用SDS-PAGE對鎳親和凝膠純化后的γ-CGTase進行分子量測定。來源于Bacillussp. FJAT-44876編碼的蛋白質由711個氨基酸組成，氨基酸序列計算的理論分子量為80.039 kDa。SDS-PAGE結果顯示目的條帶分子量大約為80 kDa(圖2)，與理論值相近，表明重組酶成功表達。

2.3 γ-CGTase定性分析

圖2 純化后γ-CGTase的SDS-PAGE分析

以900 μL 15 mg/mL可溶性淀粉為底物，加入γ-CGTase (0.09 U) 在50 ℃、pH 10.0條件下反應2 h，利用HPLC對產物進行定性分析，結果如圖3所示。HPLC圖譜顯示，反應2 h時主要產物為γ-CD；此外，利用UPLC-MS (圖4) 進一步驗證，保留時間為8.370的質譜表明，此物質的[M-H]-=1 295.5，則其相對分子質量為1 297，與γ-CD標準品出峰位置及相對分子質量一致(數據未顯示)，確定該物質為γ-CD。由于CGTase種類依據反應初期其主產物類型進行判斷[4]，故進一步確定該酶為γ-CGTase。

圖3 γ-CGTase產物高效液相色譜圖

圖4 γ-CGTase產物的超高效液相色譜-質譜聯用圖

2.4 γ-CGTase的最適溫度

溫度是影響酶催化作用的一個重要因素，在最適溫度下，酶催化活性最強，酶促反應速率最大，當反應溫度高于或低于最適溫度時，酶活力均會降低進而影響酶促反應速率。由圖5可知，γ-CGTase的最適溫度為50 ℃，與現有報道的γ-CGTase最適溫度40～65 ℃接近[22-23]。γ-CGTase酶活力隨反應溫度的升高而呈上升趨勢，當溫度達到50 ℃時，其酶活力最大，酶促反應速率最快，隨后，溫度的不斷升高導致酶活力持續下降，最直接原因是高溫使酶空間結構破壞，酶活力降低。

圖5 溫度對γ-CGTase酶活力的影響

2.5 γ-CGTase的最適pH

pH是影響酶催化活性的另一個重要因素，主要原因是不同pH環境可影響酶活性中心構象，使其發生輕微變化最終導致酶催化活性改變[24]，由圖6可知，γ-CGTase最適pH為10.0，同時在7.0～11.0范圍內有80%以上的相對酶活力，表明γ-CGTase在堿性條件下酶活力較高，與其來源于堿性芽孢桿菌屬有關。就目前報道而言，γ-CGTase最適pH與Bacillussp. G-825-6[10]、Bacillusclarkii7364[11]相近，而比Bacillussp. AL-6[22]、Bacillusfirmus/lentus290-3[23]最適pH值更高，這有利于高濃度淀粉底物的糊化。此外，γ-CGTase在pH 6～11范圍內，殘余酶活力均大于70%，最適pH范圍較廣，與CGTase相關報道一致[25-26]。

圖6 pH對γ-CGTase酶活力的影響

2.6 γ-CGTase動力學參數測定

酶促反應動力學參數可表征一個酶的基本性質，米氏常數(Km)、轉化數(kcat)及最大反應速率(Vmax)不僅可判斷酶的最適底物、酶與底物親和力大小，還能確定酶促反應速率，結果如表1所示。與王磊[12]報道的來源于Bacillusclarkii7364的γ-CGTase動力學參數相比，kcat值較高，說明γ-CGTase與可溶性淀粉親和力較高。

表1 γ-CGTase的動力學參數

2.7 有機溶劑對γ-CGTase酶活力的影響

有機溶劑在當前環糊精生產中必不可少，其不僅可改變產物比例，還對CGTase酶活力產生一定影響。如圖7所示，甲醇、乙醇、環己烷、十二醇對γ-CGTase酶活力有一定的提高作用，相對而言，乙醇對γ-CGTase酶活力提高效果更為明顯，而異丙醇和正丁醇使γ-CGTase酶活力降低，主要原因是不同CGTase對有機溶劑具有不同耐受性，蛋白質結構改變程度不同，進而導致酶活力不同。

圖7 有機溶劑對γ-CGTase酶活力的影響

2.8 反應時間及淀粉濃度對γ-CGTase產物特異性影響

在實際反應過程中，因CGTase還存在偶合、水解、歧化活力，使生成的CD可被作為底物繼續反應，導致不同反應時間、不同淀粉濃度下的產物比例不同。如圖8-A所示，在0～6 h內，γ-CGTase反應體系中主產物為γ-CD且γ-CD產量呈上升趨勢，β-CD含量緩慢增加。6～7 h，γ-CD含量減少，而β-CD仍在增加，產物比例發生明顯變化，主要原因[27]可能是在環化反應進行的同時，γ-CGTase將反應生成的CD和麥芽低聚糖作為底物，通過偶合反應使CD生成線性麥芽低聚糖，而γ-CD比β-CD更適合作為γ-CGTase偶合反應底物，最終導致6～7 h內，γ-CD含量減少而β-CD含量增加。圖8-B的結果表明，高濃度淀粉反應的產物中γ-CD含量小于β-CD，而相同反應條件下，低濃度淀粉產物中γ-CD含量遠大于β-CD，主要因為反應體積一定時，高濃度淀粉分子與酶相互碰撞幾率增大，反應速率加快，生成較多的麥芽低聚糖；產物中麥芽低聚糖可進一步與CD發生偶合反應，由于γ-CD偶合速率比β-CD快，使得高濃度淀粉反應體系中生成的γ-CD含量小于β-CD。

圖8 反應時間(A)、淀粉濃度(B)對γ-CGTase產物特異性影響

2.9 不同乙醇體積分數對γ-CGTase產物特異性影響

乙醇因其危害性低、揮發性良好且抑菌性效果明顯，在改變CGTase產物特異性中得到廣泛應用[28]。為了更好地探究乙醇對改變產物特異性的效果，選擇生成β-CD含量相對較高的淀粉濃度作為底物，最終以50 mg/mL淀粉為研究對象。如圖9所示，對照組中γ-CGTase反應6 h后β-CD比γ-CD含量更多，主要因為γ-CGTase的偶合作用使γ-CD含量減少；與對照組相比，乙醇的添加明顯使γ-CD得到有效保留，原因可能是極性較高的乙醇會排除水分子進入γ-CGTase活性中心，減弱水解反應，從而減少麥芽低聚糖的產生[29]，以及乙醇與麥芽低聚糖結合減弱γ-CGTase偶合作用[30]，使γ-CD比例提高。總體來看，γ-CD含量隨乙醇最終體積分數的增加呈上升趨勢，當乙醇最終體積分數大于5%時，γ-CD含量有微弱減少，主要因為高濃度乙醇環境中，γ-CGTase酶活損失和淀粉底物利用度降低。此外，由表2可知，與對照組相比，添加乙醇后γ-CD占總CD的比例明顯增大，尤其是在10%的乙醇最終體積分數下，該比例由40.11%增加至78.20%，專一性提高了94.96%，表明乙醇在改變γ-CGTase產物特異性方面具有廣泛前景。

圖9 不同乙醇體積分數對γ-CGTase產物特異性影響

表2 不同體積分數乙醇作用下γ-CGTase產物比例

3 結論

將來源于Bacillussp. FJAT-44876的一段基因進行克隆，并在E.coliBL21(DE3)異源表達，經鎳柱純化后，對γ-CGTase進行酶學性質測定及產物特異性影響因素研究。該酶分子質量大約為80 kDa，最適溫度50 ℃，最適pH 10.0。反應時間、淀粉質量濃度及乙醇濃度均對γ-CGTase產物特異性有影響，其中乙醇影響效果顯著。與對照組相比，10%乙醇最終體積分數下，γ-CGTase作用生成的CD中γ-CD所占比例由40.11%增加至78.20%，專一性提高了94.96%。這將為γ-CD生產提供一種新型γ-CGTase，并為改變γ-CGTase產物特異性提供基礎。