含L-精氨酸和抗氧化物質組方對小鼠免疫功能影響

趙燕,趙保路

1(哈爾濱工業大學(威海) 生物工程系，山東 威海，264209) 2(中國科學院生物物理研究所，北京，100101)

L-精氨酸具有多種獨特的生理和藥理作用，包括增強免疫力、促進蛋白質合成、降低分解代謝、保護胃腸黏膜等，在臨床營養治療中發揮著重要作用[1-3]。天然抗氧化物劑含有大量能清除過量自由基的抗氧化成分，具有輔助保護心血管、降血壓、降血脂、降血糖，以及抑制神經退行性疾病等功能[4-5]。例如，銀杏黃酮和知母寧對心臟缺血再灌注損傷有輔助治療作用[6-9]，山楂黃酮具有輔助緩解中風的效果[4]，L-精氨酸、山楂提取物、知母提取物和蝦青素按一定比例混合組成的配方對心肌梗塞和中風有明顯的防治作用[10-11]、對老年癡呆癥和帕金森病也有明顯延緩作用[12]。

本文重點研究含L-精氨酸和抗氧化物質(山楂提取物、知母提取物和蝦青素)組方對小鼠免疫功能的影響，以期為其臨床應用及保健食品研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、樣品和試劑

1.1.1 實驗儀器

二氧化碳培養箱,德國Memmert公司;DMIL顯微鏡,德國徠卡公司;微量注射器、BP211D電子天平,德國Sartorius公司;UV2550分光光度儀,日本SANYO公司;5702離心機,德國Eppendorf公司。

1.1.2 實驗樣品及試劑

組方樣品由L-精氨酸(L-Arg)、山楂提取物、知母提取物和蝦青素為原料，按質量1∶1∶2∶2比例制成。RPMI1640培養液、Hank’s液，賽默飛世爾生物化學公司；胎牛血清，浙江天航科技有限公司；綿羊紅細胞(sheep red blood cell, SRBC)和雞紅細胞均由實驗室臨用制備；YAC-細胞，山東省醫科院；乳酸鋰、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamade adenine dinucleotide, NAD)、碘硝基氯化四氮唑(iodonitrote trazolium, INT)，阿拉丁試劑公司； 0.2 mol/L tris-HCl緩沖液和Triton試劑，Amresco公司；印度墨汁，索萊寶公司；甲醇、丙酮、鹽酸和異丙醇，天津康科德技術有限公司。

1.2 動物飼養和處理

SPF級雄性ICR小鼠，體重18.11～21.99 g(濟南朋悅實驗動物繁育有限公司)飼養于屏障級動物房，溫度20～26 ℃，相對濕度40～70%，照明時間12 h。共設4個免疫實驗組，每個免疫實驗組小鼠40只，分溶劑對照組和樣品低、中、高3個劑量組，每組10只小鼠。免疫一組用于遲發變態反應(delayed type hypersensitivity, DTH)實驗、血清溶血素測定、抗體生成細胞數測定；免疫二組用于小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗；免疫三組用于碳廓清實驗、臟器/體重比值的測定；免疫四組用于小鼠淋巴細胞轉化實驗和自然殺傷(natural killer, NK)細胞活性測定實驗。

1.3 劑量選擇及受試物給予方式

L-精氨酸和天然抗氧化劑配方對人體推薦量為1.6 g/60 kg·BW。動物受試物免疫功能實驗劑量按人體推薦的5倍、10倍和30倍3個劑量，分別為0.133、0.267和0.800 g/kg·BW。稱取樣品，用5 g/L羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)溶液配制，每次灌胃20 ml，對照組給與同等體積的5 g/L CMC-Na溶液。

1.4 試驗方法

參照《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)中增強免疫力功能檢驗方法進行[13]。DTH采用SRBC誘導小鼠足跖增厚法；ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗采用MTT法；抗體生成細胞檢測采用Jeme改良玻片法；血清溶血素測定采用血凝法；小鼠碳廓清試驗和小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗采用半體內法：NK細胞活性測定采用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)測定法。

1.5 數據處理與分析

采用SPSS 19.0統計軟件以X2檢驗進行數據處理，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 對小鼠體重和免疫器官比值的影響

實驗前后各劑量組小鼠體重、脾臟/體重比值及胸腺/體重比值，與對照組比較無顯著性差異(P>0.05),如表1所示。

表1 組方對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

注：空白表示無P值(下同)

2.2 對小鼠細胞免疫功能的影響

如表2所示，中、高劑量組小鼠的淋巴細胞增殖能力與對照組比較均有顯著性差異(P<0.01)，低劑量組無顯著性差異。而3個劑量組小鼠的足跖腫脹度與對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)。依據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)評判標準，本組方對小鼠的細胞免疫功能有顯著增強作用。

表2 組方對小鼠細胞免疫功能的影響

2.3 對小鼠體液免疫功能的影響

3個劑量組小鼠的抗體生成細胞數(溶血空斑數)及血清溶血素(半數溶血值)，與對照組比較，均無顯著性差異(P>0.05)，如表3所示。依據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)評判標準，本組方對小鼠的體液免疫功能無明顯效果。

表3 組方對小鼠體液免疫功能的影響

2.4 對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

3個劑量組小鼠的吞噬雞紅細胞的百分率和吞噬指數均顯著高于對照組(P<0.01)，但3個劑量組小鼠的碳廓清吞噬指數，與對照組無顯著差異(見表4)。依據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)評判標準，本組方對小鼠的單核-巨噬細胞功能有顯著增強的作用。

表4 組方對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

2.5 對小鼠NK細胞活性的影響

由表5可見，與對照組相比，中和高劑量組的NK細胞活性均顯著提升(P<0.01)，但低劑量組效果不顯著。依據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)評判標準，本組方對小鼠的NK細胞活性有顯著增強的作用。

表5 組方對小鼠NK細胞活性的影響

3 討論

L-精氨酸具有重要的營養、代謝和免疫功能。精氨酸對免疫功能的調節作用，主要包括促進細胞免疫和體液免疫功能。精氨酸-NO的免疫調控是L-精氨酸發揮生理功能的重要作用機制之一。精氨酸通過兩條代謝途徑參與全身炎癥反應：精氨酸酶I和酶Ⅱ途徑，以及過氧化途徑。L-精氨酸經一氧化氮合成酶催化生成具有生物活性的NO。NO在生物體內承擔著重要的生物功能，包括抗炎、降血壓、舒張血管等[14-17]。

山楂的果實、葉子、花都可入藥，包含多種天然抗氧化物質，如黃酮類物質、原花青素類、三萜酸類和甾酮類等[18]。山楂提取物可通過抑制磷酸二酯酶活性，增加冠狀動脈血液流量和心臟的血液輸出，減少心臟的耗氧量，保護心臟免受缺血再灌注損傷[19]。它還可用于治療早期充血性心衰、心絞痛、心律不齊、高血壓和高脂血癥[20-21]等。蝦青素屬類胡蘿卜素，是存在于魚、蝦和藻類中的一種強抗氧化劑，其抗氧化活性為β-胡蘿卜素的10倍以上、維生素E的100倍以上[22]。知母的有效成分為知母寧，是含有4個酚羥基的多酚類物質。知母寧具有清熱瀉火、滋陰潤燥、退熱消炎、抑菌殺菌、降血糖等作用[23-24]。知母寧具有很強清除自由基作用，可降低大鼠心肌缺血再灌注損傷過程產生的NO自由基和氧自由基，從而緩解心肌缺血再灌注造成的損傷 。

L-精氨酸和天然抗氧化劑有一定的協同作用，在細胞和組織體系中，既可以產生一定量的NO，又可以清除氧自由基。另外，NO和天然抗氧化劑對T-淋巴細胞免疫具有調節作用[21,25-29]。L-精氨酸和天然抗氧化劑的組方，既可以降低高脂食物喂養引起大鼠的血脂和血壓的升高，又可以降低轉基因小鼠血糖的升高，對心肌梗塞和中風有明顯的防治作用[5,10]，同時對老年癡呆癥和帕金森病有明顯的延緩作用[12]。這也為研制和開發保護血管、防治高血壓、高血脂和高血糖的健康食品和藥物提供了科學依據。

本組方由L-精氨酸和天然抗氧化物質(山楂提取物、知母提取物和蝦青素)組成，研究結果顯示該組方(中、高劑量)能顯著提高淋巴細胞增殖能力和NK細胞活性(P<0.01)，低、中、高劑量均能顯著提高小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞百分率及吞噬指數(P<0.01)。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)判定標準，該組方對小鼠具有增強免疫功能的作用。