復合天然保鮮劑對冷卻羊肉的保鮮效果

薛婉瑞，張海生，趙鑫帥，薛菁，辛相余

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

冷卻羊肉肉質細嫩、營養全面，含有豐富的維生素、磷、鈣、鐵等，尤其是鈣和鐵的含量顯著超過了牛肉和豬肉，且脂肪含量、膽固醇含量較其他肉類低，營養成分更容易被人體吸收，因此冷卻羊肉越來越暢銷，銷售范圍越來越廣。但冷卻羊肉從屠宰、排酸到切割、運輸、銷售等環節都會出現微生物污染、蛋白質及脂肪氧化、色澤劣變等問題，導致其貨架期只有3～4 d[1]，這嚴重制約了冷卻羊肉的銷售及發展。因此，如何解決上述問題并延長冷卻羊肉的貨架期，一直是近年來的研究熱點。

目前，關于冷卻羊肉的保鮮使用最廣泛的是直接添加防腐劑，我國食品中使用的防腐劑主要有苯甲酸及其鈉鹽、對羥基苯甲酸及其酯類、丙酸及其鈉鹽、二甲基二碳酸鹽等[2]，這些人工合成化學保鮮劑的副作用幾乎不可避免，潛在威脅著人體健康[3]。因此，安全性強、綠色環保、無毒副作用的天然保鮮劑備受關注。其中用于肉類保鮮的主要有：殼聚糖、溶菌酶、天然香辛料提取物、茶多酚、乳酸鏈球菌素等[4-7]。其中，殼聚糖有游離的氨基和羥基，因此具有較好的生理活性，對菌落有很好的抑制作用[8]。茶多酚具有很有的抗氧化性，因此對很多種細菌均具有很好的抑菌效果[9]，據羅愛平等[10]研究，茶多酚在冷卻肉貯藏過程中可以有效地防止油脂氧化褐變。納他霉素對真菌具有很好的抑制作用[11]，李東等[12]發現納他霉素對酵母菌以及大多數霉菌具有很好的抑菌效果。百里香和丁香在肉類中使用，不僅對大腸桿菌、葡萄球菌、黑曲霉菌等具有很好的抑制作用，還具有除膻的功效[13-16]。

許多研究表明，復合天然保鮮劑要比單一保鮮劑對于肉類的保鮮作用更加顯著[17-18]。夏靜華等[19]用茶多酚和殼聚糖復合對冷鮮羊肉的抑菌效果顯著優于單一保鮮劑。施荷等[20]用茶多酚、丁香提取物、肉桂提取物對冷卻鹿肉進行綜合保鮮,發現經過復配保鮮劑處理后的冷卻肉在冷藏期間可以更好地保持感官品質。王正云等[21]用茶多酚和殼聚糖復合涂膜保鮮冷卻肉的效果顯著優于單獨使用殼聚糖涂膜。目前關于香辛料和茶多酚等天然保鮮劑協同使用，并應用于冷卻羊肉的研究還鮮少見于報道。因此，本研究選取殼聚糖、茶多酚、納他霉素以及香辛料(百里香和丁香)4種天然保鮮劑，研究其對冷卻羊肉的抑菌效果，通過響應面優化得出其最佳復配方法，并對此方案的保鮮效果進行探究，以期為復合天然保鮮劑的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗儀器

FW400A高速萬能粉碎機，北京科偉儀器公司；BS224S電子天平，德國Sartorius公司；Z-206A離心機，德國Hemle公司；LC-167J型冰箱，青島海爾特種冰柜有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技公司；SG2型pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；C-LM3B數顯式肌肉嫩度儀，北京龍德泰達生物技術有限公司；CR-400色差儀，Konica Minolta(日本)公司。

1.1.2 材料與試劑

山羊肉，橫山香草羊肉制品有限責任公司；水溶性殼聚糖(含量99.2%，脫乙酰度≥90%)、茶多酚(含量≥95%)，河南金誠有限公司；納他霉素(含量≥95%)，浙江新銀象生物工程有限公司；百里香、丁香，榆林農貿市場。以上材料均為食品級。

試劑：95%乙醇、甲基紅、溴甲酚綠、MgO、(NH4)2SO4、NaOH、Na2CO3、硼酸，均為國產分析純。

供試菌：乳酸菌(lactic acid bacteria)、假單胞菌(Pseudomonas)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcus)、熱死環絲菌(Brochothrixthremasphacta)、酵母菌(Saccharomyce)，均為作者所在實驗室從冷卻羊肉中分離鑒定所得,培養條件如表1所示。

表1 不同微生物菌相的培養條件

1.2 實驗方法

1.2.1 單一保鮮劑的抑菌效果

(1)保鮮劑的配制

配制質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的水溶性殼聚糖溶液備用;配制質量濃度為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 g/L的茶多酚溶液備用;配制質量濃度為0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 g/L的納他霉素溶液備用;香辛料溶液：選取優質、干燥的百里香和丁香，經高速粉碎后，過40目篩，各稱3 g，分別溶于100 mL蒸餾水，80 ℃水浴2 h后離心(3 000 r/min, 15 min)，取出上清液，等體積混合(各取50 mL)，制成60 g/L的水提液，依次用蒸餾水稀釋為質量濃度20、30、40、50、60 g/L的溶液備用。

(2)單一保鮮劑的抑菌效果

活化菌種后，將不同菌液配制成含菌數為106～107CFU/mL的菌懸液，選取內徑為6 mm的牛津杯干熱滅菌并采用牛津杯試驗方法[22-23]對單一保鮮劑的效果進行測定。

(3)最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)的測定

抑菌圈直徑>6 mm所對應的保鮮劑的濃度即為最小抑菌濃度。

(4)羊肉的處理方法

將新鮮的冷卻羊肉切成50 g左右均勻塊狀，涂抹保鮮劑，保鮮膜封裝，在0～4 ℃的冷柜中保存。在第14天時，對其揮發性鹽基氮指標進行測定。

1.2.2 響應面優化

在所選取的4種保鮮劑抑菌試驗的基礎上，根據響應面Box-Behnken設計原理，選取四因素三水平的響應面分析方法，以TVB-N值為響應值，用Design Expert 8.0.5軟件進行數據的統計處理，得出最佳工藝參數。因素及水平編碼見表2。

表2 Box-Behnken設計因素和水平編碼表 單位：g/L

1.2.3 復合天然保鮮劑的保鮮效果測定

采用復合保鮮劑(殼聚糖1.8 g/L、茶多酚2.8 g/L、納他霉素0.4 g/L、香辛料44.4 g/L)對冷卻羊肉進行涂抹處理，同時設對照組(未經保鮮劑處理的肉塊)，封裝后放置4 ℃的冷柜中貯藏，每隔3 d，對各項指標進行一次測定。

(1)菌落總數：按照GB 4789.2—2010方法進行測定。

(2)pH：按照GB/T 9695.5—2008方法進行測定。

(3)揮發性鹽基氮：按照 GB 5009.228—2016進行測定。評價標準為新鮮肉為15 mg/100 g以下，冷鮮肉為20 mg/100 g以下，變質肉為20 mg/100 g以上[24]。

(4)汁液流失率：對涂抹保鮮劑后的肉塊進行稱重，每隔3 d后取出托盤中的肉塊，使用吸水紙將肉塊表面的汁液吸去，稱其質量，按公式(1)計算

(1)

式中：m,涂抹后的羊肉質量,g；m1,每隔3 d后的羊肉質量,g。

(5)蒸煮損失率：將肉塊放置于蒸煮袋中，待水浴鍋的溫度達到80 ℃時，將肉塊放置其中蒸煮，當肉樣中心溫度達到70 ℃時取出，冷卻至室溫再次稱重，計算公式如下：

(2)

式中：m,蒸煮前的肉質量,g；m2,蒸煮后的肉質量,g。

(6)剪切力：將待測肉塊放置于蒸煮袋中，待水浴鍋的溫度達到80 ℃時，將肉塊放置其中蒸煮，當肉樣中心溫度達到70 ℃時取出，冷卻至室溫，用取樣器垂直肌纖維方向取樣(取出的樣品呈柱狀)，然后橫向放置于數顯式肌肉嫩度儀上，測定其剪切力，剪切力用kg·f表示。

(7)色澤：先對色差儀進行校正，然后測定待測肉塊的L*值(亮度)、a*值(紅度)、b*值(黃度)及c*(飽和度)、h°(色調角)值，每次測定均在相同環境下進行，每個待測肉樣進行5次平行測定，結果取平均值。

(3)

(4)

1.2.4 數據分析

采用Design-expert軟件和SPSS 17.0 軟件(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)對測定的數據進行處理分析。不同字母表示在0.05水平上差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 單一保鮮劑的抑菌效果

2.1.1 殼聚糖的抑菌效果

如圖1所示，隨著殼聚糖濃度升高，酵母菌的抑菌圈直徑幾乎不變，大腸桿菌、乳酸菌一直在增加，假單胞菌、葡萄球菌先升后降。可見，殼聚糖對酵母菌以外的5種菌落均有較為顯著的抑制效果，殼聚糖濃度為2.0 g/L時，對冷卻羊肉腐敗菌的優勢菌落假單胞菌的抑制作用最好。殼聚糖濃度為2.5 g/L時，對腸桿菌科、熱死環絲菌的抑制作用最好，對乳酸菌及葡萄球菌的抑菌效果有所下降。

圖1 殼聚糖對不同菌株的抑制效果

2.1.2 茶多酚的抑菌效果

如圖2所示，隨著茶多酚質量濃度升高，各菌株抑菌圈直徑變化都較顯著，乳酸菌的抑菌圈直徑在茶多酚質量濃度為7.0 g/L時最顯著；超過7.0 g/L時，大腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌的抑菌圈直徑反而下降；茶多酚質量濃度為9.0 g/L時，對熱死環絲菌和酵母菌抑制效果顯著。可見，茶多酚對各種細菌均有較好的抑制作用，但濃度不同，抑制效果最佳的菌株也不同。

圖2 茶多酚對不同菌株的抑制效果

2.1.3 納他霉素的抑菌效果

如圖3所示，隨著納他霉素濃度的升高，酵母菌的抑菌圈直徑增加幅度較大，葡萄球菌有很小變化，其他菌株抑菌圈直徑幾乎不變。這是由于納他霉素對幾乎所有的霉菌和酵母都具有抗性，但對細菌和病毒則無效。可見納他霉素對酵母菌有明顯的抑制作用，且隨著納他霉素濃度的升高，抑制效果顯著提高。

圖3 納他霉素對不同菌株的抑制效果

2.1.4 香辛料的抑菌效果

如圖4所示，隨著香辛料濃度的升高，乳酸菌和酵母菌抑菌圈的直徑變化不大，其他菌株的抑菌圈直徑在香辛料濃度≤50 g/L時，變化也不大。香辛料濃度為60 g/L時，假單胞菌的抑菌圈直徑變化最顯著，大腸桿菌、葡萄球菌其次。由此可見，香辛料對乳酸菌和酵母菌無明顯抑制效果，對其他腐敗菌有抑制作用，但在其低濃度時抑制效果并不明顯，當濃度達到60 g/L時，對假單胞菌抑制效果最顯著，大腸桿菌、葡萄球菌和熱死環絲菌抑制效果較好。

圖4 香辛料對不同菌株的抑制效果

2.2 響應面優化結果

2.2.1 二次響應面回歸模型的建立與分析

基于上述單一保鮮劑抑菌試驗的結果，以揮發性鹽基氮[24](TVB-N)為響應值，通過四因素三水平的Box-Behnken試驗設計和響應面分析方法，確定復合保鮮劑的最佳配比，結果見表3。

表3 Box-Behnken試驗結果

續表3

序號殼聚糖X1/( g·L-1)茶多酚X2/( g·L-1)納他霉素X3/( g·L-1)香辛料X4/( g·L-1)揮發性鹽基氮/[mg·(100 g)-1]19-101013.3120101014.01210-10-112.9922010-113.86230-10111.5124010114.792500008.232600009.052700008.292800007.932900008.38

應用Design Expert軟件對結果進行分析，各試驗因素對響應值的影響可用以下多元二次回歸方程(未去除不顯著項)表示：

1/R=0.12+0.009 242X1-0.002 639X2-0.002 743X3+0.003 034X4-0.000 614 8X1X2-0.01X1X3+0.007 487X1X4-0.002 209X2X3-0.003 609X2X4+0.001 427X3X4-0.014X12-0.022X22-0.025X32-0.022X42

表4 響應面分析試驗方差結果

2.2.2 兩因子交互作用分析

根據回歸方程作3D曲面圖，考察其形狀與顏色變化，分析茶多酚、殼聚糖、納他霉素、香辛料對于響應值的影響。各因素對TVB-N值的影響的響應面見圖5。

圖5-a顯示了在納他霉素和香辛料為最佳值時(C=0.4，D=44.4)，本實驗水平范圍內，殼聚糖和茶多酚兩因子交互作用不顯著。隨著殼聚糖和茶多酚濃度的增大，TVB-N值先減小后增大，且茶多酚對TVB-N值的影響比殼聚糖的影響弱。

a-殼聚糖和茶多酚;b-殼聚糖和納他霉素;c-殼聚糖和香辛料;d-茶多酚和納他霉素;e-茶多酚和香辛料;f-納他霉素和香辛料

圖5-b顯示了茶多酚和香辛料處于最佳水平(B=2.8，D=44.4)時，本實驗水平范圍內，殼聚糖和納他霉素兩因子交互作用極顯著。隨著殼聚糖和納他霉素濃度的增大，TVB-N值先減小后增大，并且當殼聚糖濃度增大時，TVB-N值不斷減小，說明殼聚糖對TVB-N值有很好的抑制作用。圖5-c顯示了在茶多酚和納他霉素為最佳值(B=2.8，C=0.4)時，本實驗水平范圍內，殼聚糖和香辛料兩因子交互作用顯著。隨著殼聚糖和香辛料濃度的增大，羊肉的TVB-N值不斷減小，再繼續增大時TVB-N值反而隨之增大。圖5-d顯示了在殼聚糖和香辛料為最佳值(A=1.8，D=44.4)時，本實驗水平范圍內，茶多酚和納他霉素兩因子交互作用不顯著。隨著茶多酚和納他霉素濃度的增大，羊肉的TVB-N值不斷減小，但再繼續增大時TVB-N值會迅速增大。圖5-e顯示了在殼聚糖和納他霉素為最佳值(A=1.8，C=0.4)時，本實驗水平范圍內，茶多酚和香辛料兩因子交互作用不顯著。隨著茶多酚和香辛料濃度的增大，羊肉的TVB-N值呈現出先減小后增大的趨勢。圖5-f顯示了在殼聚糖和茶多酚為最佳值(A=1.8，B=2.8)時，本實驗水平范圍內，納他霉素和香辛料兩因子交互作用不顯著。隨著納他霉素和香辛料濃度的增大，羊肉的TVB-N值先減小后增大。

2.2.3 最優條件的確定和驗證

通過Design Expert軟件對最佳配方進行預測，獲得冷卻羊肉復合保鮮劑最佳配方為：殼聚糖0.18%、茶多酚0.28%、納他霉素0.04%、香辛料4.44%，羊肉的TVB-N理論值為7.86 mg/100 g，為檢驗響應曲面法優化結果的可靠性，采用上述試驗參數對冷卻托盤羊肉進行涂抹處理，在4 ℃條件下貯藏14 d后，對其TVB-N值進行測定，得到其實際值為7.47 mg/g。驗證值與理論值間的匹配度達95.04%，說明利用該模型對冷卻羊肉復合保鮮劑的配方進行優化是可行的，得到的工藝參數具有實際應用價值。

2.3 復合保鮮劑對冷卻羊肉菌落總數的影響

2.3.1 復合保鮮劑對冷卻羊肉菌落總數的影響

如圖6所示，隨著貯藏時間的延長，冷卻羊肉的菌落總數均逐漸增加，對照組的增幅顯著大于處理組。貯藏6 d時，對照組的菌落總數達到6 lg(CFU/g)，已超過國家規定的冷鮮羊肉允許的菌落總數106CFU/g，而處理組冷卻羊肉在貯藏15 d時，其菌落總數僅為5.11 lg(CFU/g)，低于國家規定。這是因為殼聚糖在弱酸溶劑中易于溶解，溶解后的溶液中含有氨基(NH2+)，這些氨基結合負電子可以有效地抑制細菌生長繁殖。茶多酚可以增加細胞通透性，并與遺傳物質結合，干擾微生物的生長和繁殖，使其正常生長受到抑制[25]。且用復配的保鮮劑處理冷卻肉協同抑菌效果更好。

圖6 冷卻羊肉菌落總數的變化

2.3.2 復合保鮮劑對冷卻TVB-N的影響

圖7為復合保鮮劑對冷卻羊肉的TVB-N值的影響，TVB-N值是反映肉類蛋白質被分解程度的重要指標，TVB-N值越大表示肉類腐敗程度越高。隨著貯藏時間的延長，冷卻羊肉中TVB-N值不斷增加。貯藏0～9 d，對照組冷卻羊肉中TVB-N值增幅較小，9～15 d，增幅變大，貯藏15 d時，對照組冷卻羊肉中TVB-N值達到16.29 mg/100 g，超過了鮮肉中TVB-N值的最大允許值15 mg/100 g，屬于次鮮肉。而處理組冷卻羊肉中TVB-N值僅為7.47 mg/100 g，仍為鮮肉等級。在肉的貯藏過程中，蛋白質的分解主要是由細菌引起的，可見本研究所使用的復合保鮮劑對冷卻羊肉的菌落控制有很好的效果，由TVB-N值指標可知，經保鮮劑處理的托盤冷卻羊肉的貨架期可達15 d以上。

圖7 冷卻羊肉TVB-N值的變化

2.3.3 復合保鮮劑對冷卻羊肉pH的影響

圖8為復合保鮮劑對冷卻羊肉pH的影響，由于宰后羊肉中糖原酵解產生乳酸，乳酸積累從而導致羊肉pH下降，其大小影響蛋白質間的斥力，因此對羊肉的持水性有很大影響。隨著貯藏時間延長，兩組樣品的pH均呈下降趨勢。第9天時，對照組pH已降至5.53，接近蛋白質等電點，羊肉的持水性較低。相比，處理組的pH在第6天逐漸趨于穩定狀態，遠離蛋白質等電點，羊肉持水性較好。除此之外，pH值還與菌落的生長有密切關系，在弱酸性條件下，細菌和霉菌均較為適宜生長。因此，可以得出復合保鮮劑可以減緩冷卻羊肉pH下降的速度，延長冷卻羊肉的貨架期。

圖8 冷卻羊肉pH的變化

2.3.4 復合保鮮劑對冷卻羊肉保水性的影響

羊肉在貯藏期間，由于蛋白質凈電荷以及肌肉組織結構發生變化，使得細胞內水分不斷向外擴散，會造成保水性降低的問題，表現為汁液流失增加，蒸煮損失增加，這些問題不僅造成了羊肉營養物質的流失，還嚴重影響羊肉的外觀品質。因此，本試驗對其汁液流失率以及蒸煮損失率進行了測定，結果如圖9所示。

圖9 冷卻羊肉保水性的變化

可以看出，隨著貯藏天數的延長，兩組的汁液流失率均逐漸增加。對照組樣品的汁液流失率顯著高于處理組，貯藏15 d后，汁液流失率高達6.35%，處理組樣品在貯藏12 d時汁液流失率達到最高值，但僅為1.15%。同時，兩組樣品的蒸煮損失率均沒有很大的變化。且兩組樣品的蒸煮損失率之間沒有顯著性的差異(P>0.05)，可見復合保鮮劑不會影響托盤冷卻羊肉的蒸煮損失率。可能是由于保鮮劑復配處理后，對冷卻羊肉中微生物的抑制效果增強，阻止了由微生物引起的腐爛從而導致組織結構被破壞，從而造成汁液流失。同時適宜濃度的殼聚糖具有的良好的成模性使之在羊肉表面形成了一層膜，也很好的阻止了羊肉水分的流失[21]。

2.3.5 復合保鮮劑對冷卻羊肉剪切力的影響

剪切力是反映肉樣軟硬程度，彈性強弱的重要指標之一，是直接評判肉樣品質的重要參數。因此，本試驗對羊肉的剪切力進行了測定，其結果如圖10所示。

圖10 冷卻羊肉剪切力的變化

隨著貯藏時間的延長，2組樣品的剪切力均呈現出增長的態勢。對照組樣品的剪切力隨貯藏時間的延長變化較為明顯，在第12天時，剪切力已經達到了4.39 kg·f，肉質已經較硬，影響了羊肉的口感。相比對照組，處理組樣品的剪切力隨貯藏時間的延長，變化幅度較小，始終保持在3.00 kg·f以下，與第0天的羊肉的剪切力相差較小，最大程度上保留了羊肉原有的嫩度。可能是因為在貯藏期間，腐敗微生物生長繁殖破壞了肌肉細胞結構，肌原纖維發生變化，使得冷卻肉的保水性發生變化，出現汁液流失現象，從而造成冷卻肉肌肉硬度上升，而保鮮劑復配處理能夠通過抑制微生物繁殖有效減緩冷卻羊肉硬度值上升的趨勢，從而有效保持冷卻羊肉的嫩度。

2.3.6 復合保鮮劑對冷卻羊肉色澤的影響

色澤是消費者通過眼睛直接評判羊肉品質的直接指標，本實驗測定了托盤冷卻羊肉在貯藏期間的色澤變化，結果如表5所示。由表5結果分析可知，隨著貯藏天數的延長，羊肉的L*值(亮度)、a*值(紅度)、b*值(黃度)、c*(飽和度)和h°(色調角)均發生了不同程度的變化。

表5 冷卻羊肉色澤的變化

注：結果表示為5次測定的平均值±標準差；不同的小寫字母表示在0.05顯著性水平上差異顯著

對照組和處理組的L*值均隨著貯藏天數的延長不斷下降，但處理組L*值的降幅明顯小于對照組(P<0.05)。a*值隨著貯藏天數的延長也會不斷下降，但處理組a*值的下降速度比對照組a*值下降速度慢，處理組第15天時，a*值與對照組第9天時的a*值接近，差異性不顯著(P>0.05)。b*值均隨著貯藏天數的延長而不斷變大，但是處理組增幅明顯小于對照組的增幅，處理組第15天時的b*值與對照組第9天時的b*值接近，差異性不顯著(P>0.05)。處理組在第15天時的c*值與對照組第6、9天時的c*值接近，差異性不顯著(P>0.05)。對照組和處理組的h°值隨著貯藏時間的延長不斷增大，而且增幅明顯(P<0.05)，但是，處理組h°值的增幅明顯低于對照組(P<0.05)。可見，復合保鮮劑可以有效延緩L*值、a*值、b*值、c*和h°的變化。

因為c*值和h°值只與a*值和b*值有關，因此可以得出復合保鮮劑對冷卻羊肉a*值和b*值的變化均具有較好的抑制作用。這是因為色澤的變化主要是由于羊肉氧化而引起的褐變所造成的，而保鮮劑中的茶多酚具有很強的抗氧化性，因此，經過復合保鮮劑處理的冷卻羊肉一定程度上減輕了氧化所造成的褐變，從而有效的減輕了羊肉色澤的劣變。

3 結論

綜合分析以上實驗結果，在0～4 ℃貯藏條件下，天然保鮮劑對冷卻羊肉腐敗菌具有明顯的抑制作用，且通過Box-Behnken試驗得出最佳的復合保鮮劑配方，即殼聚糖0.18%、茶多酚0.28%、納他霉素0.04%、香辛料4.44%。使用上述復合保鮮劑處理冷卻羊肉，可顯著減緩羊肉菌落總數、TVB-N值的升高及pH的降低，延長冷卻羊肉貨架期至15 d以上，同時，對汁液損失率、蒸煮損失率、剪切力和色澤等羊肉的重要品質均產生有利的影響，降低水分流失，減輕褐變，很好地保持了冷卻羊肉原有品質，說明上述配方的復合保鮮劑對冷卻羊肉有很好的防腐保鮮效果。