三種晚熟甜橙冷磨精油揮發性及主體香氣成分的比較分析

李貴節，張群琳，何雅靜，談安群，張騰輝，郭莉，張萬超，鐘世浚，譚祥，孫志高*

1(西南大學 柑桔研究所，國家柑桔工程技術研究中心，重慶，400712) 2(重慶市藥物種植研究所，重慶，408435)3(重慶市功能性食品協同創新中心，重慶，400067) 4(成都市華測檢測技術有限公司，成都，610041)5(重慶文理學院 園林與生命科學學院，重慶，402160)

甜橙是產量最高的柑橘栽培品種，果皮精油是其最重要的加工產品之一。作為天然香料，甜橙油被廣泛應用于食品、香精香料、醫藥和化妝品等行業，它具有舒緩鎮靜、抗氧化、降血壓、祛痰止咳、平喘等多種功能活性[1-3]，具有重要的開發利用價值。

重慶地處國家“長江上中游柑橘優勢帶”的核心區域，是我國主要的甜橙產地和加工省份。近年來重慶大力推進柑橘晚熟產業的發展，晚熟甜橙種植面積不斷擴大[4]。不同于普通甜橙集中在冬季上市，晚熟甜橙一般于翌年3～5月成熟，對于改善柑桔品種結構和調節市場供應有重要的價值。其中，奧林達夏橙和五月紅甜橙具有豐產優質、大小適中等特性，晚熟血橙保留了塔羅科血橙肉質細嫩、風味獨特的品質，現已成為主栽的晚熟良種。雖然晚橙的推廣帶來了顯著的經濟效益，然而柑橘產業發展仍未擺脫鮮銷為主、商品化處理相對薄弱的困境；同時，橙汁加工過程中產生的皮渣和皮油水通常經簡單處理后填埋或丟棄，精深加工比例低，造成資源浪費和環境問題。對于晚熟甜橙精油的開發能夠在一定程度上減輕上述壓力，并提升晚熟甜橙的產品附加值。

不同產區、品種和制備方法會對柑橘精油的品質和各組分含量產生重要影響。NJOROGE等[5]研究發現β-水芹烯、(Z)-橙花叔醇、香橙烯等物質可作為區分伏令夏橙和華盛頓臍橙精油的關鍵物質。在前期研究中發現瓦倫西亞橘烯是重慶產伏令夏橙皮油中含量最高的倍半萜類物質，而根據文獻[5]報道，在肯尼亞伏令夏橙皮油中α-金合歡烯在倍半萜類物質中含量最高，且未檢測到瓦倫西亞橘烯。在精油制備的各類方法中，冷磨(榨)法是生產高品質甜橙精油的主要方法[6]，然而目前還未見對重慶地區晚熟甜橙冷磨精油(cold-pressed oil, CPO)的揮發性成分進行系統分析和研究的報導。

一般認為，樣品所有的揮發性物質中僅有一小部分參與構建其香氣的主體[7]。BUTTERY等[8]認為含量高且閾值低的香氣物質很可能是果品的特征香氣或主體香氣成分。香氣化合物的濃度與感受閾值的比值被定義為香氣活度值(odor activity values, OAV)，是一種分析香氣貢獻度的常用方法,通常認為OAV>1的物質對樣品香氣有顯著貢獻[9]。

本研究通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(headspace solid-phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)對重慶地區的奧林達、五月紅和晚熟血橙的冷磨果皮精油中揮發性成分進行定性和內標法定量分析，比較其揮發性物質的種類、組成及含量，并結合OAV探究各品種CPO中的主體香氣成分對整體香氣特征的貢獻，從而為本地區晚熟甜橙精油資源的開發利用提供前期數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟奧林達夏橙、五月紅甜橙和晚熟血橙果實均采于中國農業科學院柑桔研究所資源圃；環己酮(>99.5%)，Aladdin公司；乙酸辛酯(>99.5%)，源葉生物公司；C5-C25正構烷烴(色譜級)，Honeywell公司。

1.2 儀器與設備

9N50型碟片式分離機，青海農牧機械制造有限公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機，美國Thermo公司；Agilent 7890 GC-5977 MSD氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；85 μm，CAR/PDMS固相微萃取裝置，美國Supelco公司；0-40-70-100酒精密度計，同輝儀表廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 冷磨橙皮精油的制備

冷磨橙皮油的制備參考MATTHEWS[10]的方法并稍作修改，具體步驟為：分別稱取各品種甜橙果實3.3 kg，量取1.4 L自來水于玻璃容器中，在水中用不銹鋼銼板對果實表皮進行適度銼磨，使油胞破裂釋放其中的皮精油；皮精油在水中逐漸積累，達到并超過其飽和溶解量。為減少皮油成分的揮發損失，容器全程置于冰水浴中。所得皮油乳液經200目紗布過濾去除大部分不溶性皮渣后，采用碟片式分離機進行第一級離心，循環多次獲得濃縮皮油乳液，再于4 ℃高速冷凍離心機中以8 000 r/min進行二級離心，收集上層澄清精油，而后置于-18 ℃充氮密閉凍藏備用。

1.3.2 頂空固相微萃取

取50 μL精制冷磨油于18 mL頂空瓶中。用待測油樣將環己酮和乙酸辛酯分別稀釋至0.19 μmol/mL和0.20 μmol/mL，取2.5 μL稀釋液作為內標加入瓶中，充入氮氣后密閉。樣品于40 ℃水浴中平衡30 min，靜態頂空固相微萃取吸附15 s，立刻進行GC-MS檢測。

1.3.3 GC-MS檢測條件

氣相條件：DB-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度230 ℃，不分流；升溫程序： 35 ℃保持3 min，以6 ℃/min升溫至203 ℃，再以10 ℃/min升溫至243 ℃并保持3 min。載氣為高純氦氣，氣體流速：1.2 mL/min。

質譜條件：電子轟擊離子源，70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z：40～350。

1.4 數據分析與統計

定性分析：采用Wiley 2010版和Nist 2014版整合譜庫做質譜檢索匹配，結合DB-5 MS色譜柱的保留指數進行定性。

保留指數(retention index, RI)：將C5-C25正構烷烴混合標準品按1.3.3條件進樣，確定各物質保留時間，根據公式(1)進行計算：

(1)

式中：t′(i)、t′(z)、t′(z+1)分別代表待測組分及碳數為z、z+1正構烷烴的調整保留時間，min。

內標法定量分析：以環己酮和乙酸辛酯為內標物質，環己酮用于D-檸檬烯及其之前出峰物質的定量分析，乙酸辛酯用于D-檸檬烯之后物質的定量分析。待測組分在精油中的物質的量濃度X(μmol/mL)根據公式(2)計算：

(2)

式中：Ai,待測組分峰面積；ns，內標物物質的量(μmol)；As，內標物的峰面積；V，頂空瓶中樣品體積，mL；f，摩爾相對校正因子。在70 eV電子轟擊條件下，可近似認為等摩爾的各目標物質和內標物的離子化效率相同或相近，其質譜響應(TIC峰面積)也相近，故以摩爾相對校正因子約等于1進行定量計算。

所有實驗均測定3組平行樣品，實驗結果用平均值±標準偏差表示。

1.5 香氣活度值分析

香氣活度值通過公式(3)計算：

OAV=揮發性成分濃度÷香氣閾值

(3)

其中各物質香氣閾值由查閱相關文獻[11-12]得到。

2 結果與分析

2.1 冷磨精油中揮發性物質的定性和定量分析

經SPME富集的3個品種甜橙CPO揮發性物質的總離子流圖如圖1所示。

a-奧林達；b- 五月紅；c-晚熟血橙

通過對色譜峰進行譜庫檢索及保留指數對比[13-14]，從3個CPO中初步鑒定出68種揮發性成分，其中63個物質經兩個質譜庫檢索和RI值雙重定性確認，5個物質未檢索到對應RI值，但兩個質譜庫檢索匹配度均高于93%。奧林達、五月紅和晚熟血橙中分別含有53、54和52種揮發性物質，占各自總離子響應的98.93%、99.58%及99.16%。各揮發性物質的名稱、性質及濃度信息見表1。

表1 三個晚熟品種甜橙冷磨精油中的揮發性物質

續表1

序號物質名稱質譜庫匹配度/%RI文獻值RI計算值奧林達五月紅血橙揮發性物質濃度/(μmol·mL-1)奧林達五月紅血橙定性方法分類46胡椒酮 Piperitone911 253--1 254--0.24±0.02MS、RI酮類47香芹鞣酮 (+)-Carvotanacetone921 247-1 254--0.33±0.16-MS、RI酮類48香芹烯酮 Carvenone951 258-1 2621 262-1.23±0.050.56±0.09MS、RI酮類49香葉醛 Geranial941 2701 2691 2691 2701.63±0.101.12±0.310.22±0.01MS、RI醛類50紫蘇醛 Perillaldehyde931 2791 2811 2811 2811.17±0.160.87±0.030.63±0.18MS、RI醛類51百里酚m-Thymol891 290-1 2901 290-0.49±0.060.41±0.02MS、RI酚類52香芹酚 Carvacrol861 2991 3001 2981 2980.36±0.021.83±0.510.63±0.09MS、RI酚類537-甲基-1-十一碳烯 7-Methyl-1-undecene93NA-1 318--0.45±0.01-MS其他54α-畢澄茄烯 α-Cubebene821 3511 352--0.21±0.00--MS、RI倍半萜類55古巴烯 Copaene921 3761 3831 3821 3830.72±0.030.44±0.020.5±0.02MS、RI倍半萜類56β-欖香烯 β-Elemene821 3911 394--0.27±0.01--MS、RI倍半萜類57十二醛 Dodecanal841 4071 4101 410-0.47±0.040.09±0.03-MS、RI醛類58反式-石竹烯 trans-Caryophyllene851 4321 4291 4291 4290.26±0.030.10±0.010.21±0.01MS、RI倍半萜類59β-古巴烯 β-Copaene931 432--1 438--0.17±0.02MS、RI倍半萜類60蛇麻烯 Humulene851 4401 438-0.29±0.01--MS、RI倍半萜類61α-姜黃烯 α-Curcumene811 4811 4841 4841 4840.16±0.04tr0.18±0.00MS、RI倍半萜類62β-蛇床烯β-Selinene911 4901 492--0.15±0.03--MS、RI倍半萜類63γ-古蕓烯γ-Gurjunene891 477-1 493--0.18±0.00-MS、RI倍半萜類64β-花柏烯 β-Chamigrene931 478--1 492--0.25±0.02MS、RI倍半萜類65瓦倫西亞橘烯 Valencene931 5061 5001 5001 5002.28±0.251.37±0.063.85±0.26MS、RI倍半萜類66δ-杜松萜烯 δ-Cadinene841 5241 5241 5231 5230.27±0.020.13±0.010.19±0.00MS、RI倍半萜類67順式-去氫白菖烯 cis-Calamenene881 5211 5281 5281 5280.79±0.140.80±0.170.97±0.06MS、RI倍半萜類68卡達烯 Cadalene871 6771 6881 6891 688trtrtrMS、RI倍半萜類

注：MS,質譜定性；RI，保留指數定性；NA 未在文獻中找到對應RI；* 初步鑒定；- 未檢出；tr 檢測到痕量但無法準確定量分析

2.2 不同品種精油中揮發性物質的分類比較

對精油樣品中的揮發性成分按結構歸類，各類別化合物數量的分布情況如圖2所示。

圖2 三個晚熟品種甜橙冷磨精油中揮發性物質種類及其所含化合物數量

3個品種CPO共同含有40個可定量成分，約占各品種CPO揮發性物質總數的2/3，包括：單萜類15個、倍半萜類7個、醇類7個、醛酮類10個及其他化合物1個，這些共有成分形成了甜橙冷磨精油揮發性物質的基本組成構架。在這些物質中，單萜類的D-檸檬烯濃度最高(見表1)，但其在精油中的含量均遠低于80%。天然柑橘精油商品化過程中常會進行脫萜處理，即通過精餾將D-檸檬烯部分乃至全部脫除，從而提高其他揮發性成分及主要香氣物質的濃度[15]。本研究中，3個重慶主栽晚熟甜橙CPO中D-檸檬烯含量較低，對其脫萜所用能耗也更低，因而適用于加工濃縮(高倍)精油。除D-檸檬烯外的各類揮發性物質在3個品種甜橙CPO中的物質的量濃度信息如表2所示。

表2 三個晚熟品種甜橙冷磨精油中除D-檸檬烯外各類揮發性物質的總濃度 單位：μmol/mL

注：“*”不包括D-檸檬烯

單萜類化合物是甜橙冷磨精油的主要成分。從奧林達、五月紅、晚熟血橙中分別鑒定出17、17和18種單萜類化合物，其中β-月桂烯(3.5%～4.2%)、α-蒎烯(1.7%～2.1%)和檜烯(0.8%～1.6%)等物質的量最高。γ-萜品烯在甜橙中鮮有報道[16]，本研究的3種樣品中，其占單萜類成分的比例均大于2%。3種精油在單萜類上的組成差異體現在一些濃度極低的物質上，如(-)-β-香茅烯與α-萜品烯僅在晚熟血橙中鑒定出，而3-薄荷烯僅在奧林達和五月紅中鑒定出。

倍半萜類化合物于3種CPO中濃度都較低，與文獻報道一致[17]。在奧林達、五月紅和晚熟血橙中其總濃度分別為5.40、3.02和6.32 μmol/mL。瓦倫西亞橘烯在所有樣品中均是濃度最高的倍半萜類物質，其中晚熟血橙CPO所含瓦倫西亞橘烯占其倍半萜類物質總量的60.91%。倍半萜類成分在3個品種CPO中的分布差異顯著(P<0.05)，α-畢澄茄烯、β-欖香烯、蛇麻烯、β-蛇床烯僅在奧林達CPO中發現，γ-古蕓烯僅在五月紅CPO中檢出，而β-古巴烯、β-花柏烯僅見于晚熟血橙CPO中。這些物質或可成為區別各品種CPO的特征揮發性成分。

在奧林達、五月紅和晚熟血橙CPO中分別檢測出11、13和11個醇/酚類物質，其中芳樟醇在3個品種中均為最高；其他共有物質包括松油烯-4-醇、α-松油醇、反式-香芹醇、順式-香芹醇和香芹酚。異香芹醇僅在奧林達CPO中檢出，在其他2種CPO中未檢出；五月紅CPO中未檢出香茅醇，但其所含1-辛醇未在其他品種中發現。

多種醛酮被認為是柑橘精油的重要呈香物質[18]，一般由醇類氧化或是酸還原所得。辛醛、癸醛、壬醛、己醛、對-薄荷-1-烯-9-醛及香芹酮是3個CPO中共有的主要醛酮類物質，占其物質總量的70%以上。香茅醛是一種閾值很低(油中為0.1 μg/g)的呈現花香味的揮發性物質[9]，其在奧林達和五月紅CPO中的濃度較高，分別為15.80 μmol/mL和14.73 μmol/mL，但在晚熟血橙中并未檢出。

在3種晚熟甜橙CPO中未發現能被準確定性的酯類物質，此外還檢出2種其他類別物質，主要為脂肪烴類化合物。它們不被認為是柑橘精油的呈香物質[6, 19-20]。

2.3 不同品種精油的香氣活度分析與香氣特征比較

不同的揮發性物質由于自身香氣閾值以及在各品種CPO中的濃度不同，導致它們對整體香氣的貢獻存在差異。測得奧林達、五月紅和晚熟血橙3個品種的CPO密度分別為0.84、0.84和0.85 g/mL，利用文獻記載的香氣閾值計算3個CPO中各揮發性物質的OAV，根據OAV>1的標準整理出對精油香氣有顯著貢獻的香氣物質共30個，并依據數據庫[13-14]和文獻資料[17, 21-24]按各物質香氣特征歸納其主體香氣類別，結果如表3所示。

表3 三個晚熟品種甜橙冷磨精油中主體香氣物質的香氣活度值和香氣特征描述

續表3

物質名稱香氣閾值/(μg·mg-1)香氣活度值(OAVs)奧林達五月紅血橙香氣特征描述癸醛 Decanal0.245b10 576 5 309 3 686 [D] 油脂香香茅醇 Citronellol0.04a2 428 -5 612 [F] 花香順式-香芹醇 cis-Carveol0.25a169 348 300 [H] 香菜香橙花醛 Neral0.888b297 215 -[E] 柑橘香香芹酮 (-)-Carvone0.1a1 842 4 139 3 116 [H] 薄荷香香葉醛 Geranial0.41b508 349 69 [E] 柑橘香[22]紫蘇醛 Perillaldehyde0.29b509 379 277 [H] 草本香[23]百里酚 m-Thymol0.188a-329 278 [C] 木香 香芹酚 Carvacrol0.07a649 3 299 1 149 [H] 香菜香十二醛 Dodecanal0.063b1 155 221 -[E] 柑橘香[24]反式-石竹烯 trans-Caryophyllene0.15a298 114 243 [C] 木香

注：a,物質在水中的閾值;b,物質在油中的閾值；-，未檢出；[A～H] 分別代表：青香、松香、木香、油脂香、柑橘香、花香、甜香及草本香等8個香氣屬性類別

由表3可知，3個CPO中OAV較高的物質包括辛醛、癸醛、D-檸檬烯、芳樟醇、壬醛、對傘花烴、α-萜品油烯、己醛、α-蒎烯、β-月桂烯等，該結果與相關文獻[10, 25]報道中的甜橙精油主要香味貢獻成分一致。D-檸檬烯對于柑橘類產品香氣的作用目前尚存爭議[26, 27]，有學者通過下調檸檬烯合成酶表達使其在橙皮中的濃度降低90倍，感官評價卻發現處理組與對照組間并無顯著差異[28]，而另有研究認為D-檸檬烯存在與柑橘其他氣味成分的協同作用[29]。鑒于表3中D-檸檬烯所呈現的高OAV，本文依舊將其納入CPO的主體香氣成分內。

通過表3中揮發性物質所對應香氣描述詞，將30個揮發性物質歸為柑橘香韻(citrusy)、油脂香韻(fatty)、花香韻(flower)、青草香韻(green)、草本香韻(herb)、甜香韻(sweet)、松香韻(piney)及木香韻(woody)共8種香氣屬性。分別計算3個CPO中8種主體香氣屬性各自的總香氣活度值，結果如圖3所示。

圖3 各主體香氣屬性的總香氣活度值在3個晚熟品種 甜橙CPO中的分布差異

由圖3可知，3個CPO中橘香、花香和脂香屬性的總OAV最高，木香和松香屬性相對較低。花香、脂香和甜香的總OAV在奧林達CPO中最高，在晚熟血橙CPO中最低。芳樟醇被認為是橙皮油的三大主要香氣成分之一，具有明確的花香氣味[30]；血橙CPO中芳樟醇僅為奧林達和五月紅CPO中的68.8%和75.2%，同時還缺失了香茅醛，因而花香屬性較弱。與之相對，晚熟血橙CPO中松香和木香成分的總香氣活度最高，而奧林達CPO中最低，α-蒎烯和百里酚的含量差異或是其中的主要因素。

3 結論

通過HS-SPME-GC-MS分析從3個重慶主栽晚熟甜橙品種的果皮冷磨精油中共鑒定出68種揮發性物質，主要類別包括單萜、倍半萜、醇酚類以及醛酮等類，3個品種的D-檸檬烯含量均較低。奧林達夏橙、五月紅甜橙和晚熟血橙CPO中分別鑒定出53、54和52種揮發性物質，通過香氣活度值分析，發現3個品種CPO的主要香氣貢獻物質為對傘花烴、辛醛、己醛、壬醛、癸醛、芳樟醇、D-檸檬烯、α-萜品油烯、α-蒎烯、β-月桂烯等，形成了橘香、脂香、青香、松香、花香、甜香、木香和草本香等8種主體香氣屬性，其中橘香、花香和脂香是3個品種精油共同的主體香韻。花香、脂香及甜香總OAV在奧林達夏橙CPO中較高，而松香和木香總OAV在晚熟血橙CPO中較高。可充分利用不同晚熟甜橙CPO的主體香氣特征開發細分產品，實現對晚熟甜橙資源的綜合利用，進一步提升其經濟價值。