響應面法優化超壓腸桿菌利用黃水生產微生物絮凝劑

楊慧敏，曾禮蘭，賀富強，胡 承

（四川大學 生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064）

微生物絮凝劑是一類具有絮凝活性的微生物體或微生物代謝產物或分泌物，其主要成分是多糖、蛋白質及脫氧核糖核酸等物質[1-3]。目前，微生物絮凝劑主要應用于廢水懸浮顆粒的去除、乳濁液的油水分離、改善污泥沉降性能、降低高濃度有機廢水中的有機物質、重金屬的富集[4-7]。微生物絮凝劑具有無毒性、無二次污染、應用范圍廣等優點[8-9]，但由于生產成本高，導致其工業化發展緩慢。

目前，眾多研究以淀粉廢水[10-11]、蜜糖廢水[12]、養豬廢水[13]、乳制品廢水[14]、啤酒廢水[15-16]等作為替代培養基生產微生物絮凝劑。利用黃水作替代培養基，生產微生物絮凝劑的報道較少[17]。

黃水是傳統濃香型白酒釀造中特有副產物[18]。一般情況下，每生產1000kg大曲酒，大約會產生黃水300～400kg[19]。黃水pH范圍在3～4，高化學需氧量（chemicaloxygendemand，COD）25 000～40 000 mg/L；高生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）25 000～30 000 mg/L[20]。黃水中含有大量的有機物質，如含氮化合物、還原糖及種類豐富的有機酸、醇、醛等物質，經氣相色譜分析，黃水中含有8.2 g/L的還原糖、2.6%的乙醇、4.73 g/L的總酸以及多種微量成分[21]。

本研究以黃水作為替代培養基，采用單因素及響應面試驗優化超壓腸桿菌（Enterobacter nimipressuralis）利用黃水培養基生產微生物絮凝劑培養條件，既降低了微生物絮凝劑的生產成本，也有效的降低了黃水中的有機物濃度，達到以廢治廢，為生產微生物絮凝劑的廉價培養基選取提供了科學依據，也探索了廢水資源化利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與黃水

超壓腸桿菌（Enterobacter nimipressuralis）：由本實驗室篩選和保藏；黃水：取自四川省成都市水井坊公司水井坊基地，密封保存在4 ℃冰箱中，備用。

1.1.2 化學試劑

NaOH、鹽酸、CaCl2（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉膏（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；高嶺土：天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.1.3 培養基

發酵培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，去離子水1 000 mL，pH7.2～7.4。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PRACTUM224-1CN電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；PHS-2C筆式pH計：上?？祪x儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司；HWS-150立式恒溫培養搖床：上海世平實驗設備有限公司；721E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物絮凝劑的制備

將菌株按5%的接種量接種于發酵培養基中，在設定的條件下，經培養獲得的發酵液即為微生物絮凝劑。

1.3.2 絮凝率的測定[22]

稱取0.5 g高嶺土置于燒杯中，加入98 mL去離子水，50 g/L的CaCl2溶液1 mL，1 mL發酵液，180 r/min充分攪拌3 min，靜置10 min。測定上清液的OD550nm值，每組實驗均做3個平行，去離子水作空白對照。絮凝率計算公式如下：

式中：η為絮凝率，%；A為絮凝處理前上清液于波長550 nm處的吸光度值；B為絮凝處理后上清液于波長550 nm處的吸光度值。

1.3.3 黃水培養基的制備

用去離子水將黃水按不同體積比稀釋并配制為黃水培養基，使黃水所占的體積比分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%；同時將黃水與牛肉膏蛋白胨培養基按不同體積比混合，配制成黃水與牛肉膏蛋白胨混合培養基，如上，黃水所占體積比為10%～100%。將菌株分別接種到稀釋為不同倍數的黃水培養基中和混合培養基中。在恒溫搖床中，溫度32 ℃、130 r/min，振蕩培養72 h，測定發酵液絮凝率。

1.3.4 培養基優化單因素試驗

最佳碳氮源的確定：分別以5 g/L的葡萄糖、2.5 g/L蔗糖及2.5 g/L可溶性淀粉作為碳源，5 g/L NaCl為無機鹽，分別加入5 g/L蛋白胨、5 g/L牛肉膏、5 g/L酵母浸粉、5 g/L胰蛋白胨、2.5 g/L NH4Cl、1 g/L尿素，測定發酵液絮凝率。

最佳無機鹽的確定：以10%黃水、5 g/L葡萄糖和1 g/L尿素為發酵培養基，分別添加2.5 g/L NaCl、CaCl2、MgSO4、KCl、FeSO4，接入5%的種子液，培養后測定發酵液絮凝率。

分別調整黃水體積分數為5%、10%、15%、20%、25%、30%；葡萄糖添加量為2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L、15.0 g/L；尿素添加量為0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L、1.50 g/L、1.75 g/L；KCl添加量為1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L；接種量為4%、6%、8%、10%、12%、14%；培養基初始pH值為5、6、7、8、9?？疾禳S水體積比、葡萄糖添加量、尿素添加量、KCl添加量、接種量及初始pH值對發酵液絮凝率的影響。

1.3.5 培養條件Plackett-Burman試驗設計

以單因素試驗結果為依據，根據Plackett-Burman試驗設計原理，采用N=12試驗設計，以絮凝率（Y）為響應值，運用Design Expert 8.0.6軟件對黃水體積分數（A）、葡萄糖添加量（B）、尿素添加量（C）、KCl添加量（D）、接種量（E）、初始pH（F）這6個因素進行研究，每一個自變量的高低水平分別以1、-1進行編碼，Plackett-Burman試驗設計因素與水平見表1。

表1 培養基成分優化Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests for medium components optimization

1.3.6 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman測試結果中每個顯著影響因素效應的大小，設定步長和變化方向，找出峰值，并快速逼近最佳值區域。

1.3.7 培養基優化響應面試驗設計

根據最佳爬坡試驗的結果，將絮凝劑最高的一組作為中心組合試驗設計的中心點，根據Box-Behnken試驗原理[23]，運用Design Expert 8.0.6軟件以KCl添加量（A）、尿素添加量（B）、黃水體積分數（C）為評價因素，以絮凝率（Y）為響應值，Box-Behnken試驗設計編碼值與水平見表2。

表2 培養基成分優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests for medium components optimization

2 結果與分析

2.1 黃水作為替代培養基制備微生物絮凝劑

2.1.1 產絮菌經黃水培養和混合培養對絮凝效果的影響

由圖1可知，菌株經10%的黃水培養與10%的混合培養的絮凝率基本持平，分別為73.83%和74.25%。與混合培養基相比，黃水的成本更低，而且達到了廢物利用的效果，因此，最適黃水體積分數為10%。

圖1 產絮凝劑菌經純黃水培養和混合培養對絮凝效果的影響Fig.1 Effect of flocculant-producing bactrium after pure Huangshui medium and mixed medium culture on flocculation efficiency

2.1.2 不同碳氮源對絮凝效果的影響

碳氮源種類對產絮菌分泌微生物絮凝劑有一定的影響[24]。由圖2可知，菌株可以利用多種碳氮源來產生微生物絮凝劑，當碳氮源組合為葡萄糖和尿素時，菌株的絮凝率為77.35%，所以菌株的最佳碳氮源組合是葡萄糖和尿素。

圖2 不同碳氮源對絮凝效果的影響Fig.2 Effect of different carbon and nitrogen sources on flocculation efficiency

2.1.3 不同無機鹽對絮凝效果的影響

在培養基中加入無機鹽，其中的金屬離子能中和并使生物高分子表面官能團所帶的負電荷穩定，有效的促進產絮菌的產絮性能[25]。由圖3可知，KCl是最佳無機鹽。

圖3 不同無機鹽對絮凝效果的影響Fig.3 Effect of different inorganic salts on flocculation efficiency

2.2 培養條件優化單因素試驗

2.2.1 不同體積分數黃水對絮凝效果的影響

由圖4可知，絮凝率隨著黃水體積分數的增加，呈現先快速增加又緩慢下降的趨勢。當黃水體積分數為15%時，絮凝率最大為78.75%。黃水中的乙醇可以促進產絮菌生產微生物絮凝劑[10]。黃水體積分數過高時其中不利于菌體生存繁殖的物質（如糠醛）積累或黃水濃度過低其中的有機物質不足，不利于產絮菌的生長，則抑制了其代謝產物的分泌。因此，最佳黃水體積分數為15%。

圖4 不同體積分數黃水對絮凝效果的影響Fig.4 Effect of different volume fraction of Huangshui on flocculation efficiency

2.2.2 不同葡萄糖添加量對絮凝效果的影響

如圖5所示，當葡萄糖添加量＜7.5 g/L時，絮凝率隨著葡萄糖添加量的增加而增加。當葡萄糖添加量＞7.5 g/L時，絮凝率隨著葡萄糖添加量的增加反而呈現下降趨勢。當葡萄糖添加量為7.5 g/L時，絮凝率最大為80.7%。因此，最佳葡萄糖添加量為7.5 g/L。

圖5 不同葡萄糖添加量對絮凝效果的影響Fig.5 Effect of different glucose addition on flocculation efficiency

2.2.3 不同尿素添加量對絮凝效果的影響

如圖6所示，當尿素添加量＜1.25 g/L時，絮凝率隨著尿素添加量的增加而迅速增加；當尿素添加量＞1.25 g/L時，絮凝率反而呈現下降趨勢。當尿素添加量為1.25 g/L時，絮凝率最大為78.9%。因此，最佳尿素添加量為1.25 g/L。

圖6 不同尿素添加量對絮凝效果的影響Fig.6 Effect of different urea addition on flocculation efficiency

2.2.4 不同KCl添加量對絮凝效果的影響

如圖7所示，當KCl添加量＜2.5 g/L時，絮凝率隨著KCl添加量的增加而升高；當KCl添加量＞2.5 g/L時，絮凝率隨著KCl添加量的增加反而呈現下降趨勢。當KCl添加量為2.5g/L時，絮凝率最大為80.77%。因此，最佳KCl添加量為2.5 g/L。

圖7 不同KCl添加量對絮凝效果的影響Fig.7 Effect of different KCl addition on flocculation efficiency

2.2.5 不同接種量對絮凝效果的影響

圖8 不同接種量對絮凝效果的影響Fig.8 Effect of different inoculum on flocculation efficiency

如圖8所示，當接種量較低時，絮凝率較低，隨著接種量在4%～6%范圍內的增加，絮凝率也隨之上升，當接種量為6%時，絮凝率最大為81.74%。當接種量＞6%，雖然適應期縮短了許多，但是由于培養基營養成分一定，營養消耗過快，菌體易老化不利于產物的生成和積累，因而導致絮凝率下降。因此，最佳接種量為6%。

2.2.6 初始pH不同對絮凝率的影響

如圖9所示，當培養基初始pH為5～7時，絮凝率隨初始pH增加而增大；當培養基初始pH為7時，絮凝率最大為79.32%；當初始pH＞7之后，絮凝率稍有下降。因此，最佳初始pH為7。

圖9 不同初始pH值對絮凝效果的影響Fig.9 Effect of different initial pH on flocculation efficiency

2.3 Plackett-Burman試驗設計結果

基于單因素試驗，以絮凝率（Y）為響應值，采用Plackett-Burman（N=12）試驗考察影響絮凝效果的8個因素的顯著性。Plackett-Burman試驗的設計和結果見表3，主效應分析采用Design-Expert8.0.6軟件進行，結果見表4。

表3 培養基成分優化Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman tests for medium components optimization

通過F值檢測相關因素的顯著性，由表4可知，模型的F值16.98，P值為0.003 5＜0.05，說明得出的一階回歸模型是顯著的，擬合程度高，可以用于理論預測。因素黃水體積分數（P=0.002 1＜0.05）、尿素添加量（P=0.016 2＜0.05）、KCl添加量（P=0.001 2＜0.05）為顯著性因素。因此對黃水體積分數、尿素添加量和KCl添加量這3個顯著因子進一步優化。

表4 培養基成分優化Plackett-Burman試驗主效應分析Table 4 Main effects analysis of Plackett-Burman tests for medium components optimization

2.4 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是確定逼近中心點的顯著影響因素的取值以及提高絮凝率，黃水體積分數、尿素添加量及KCl添加量這3個因素的變化方向和步長的試驗設計及結果見表5。由表5可知，3個顯著影響因素的中心點在第3組試驗附近，因此確定第3組的水平作為響應面試驗的中心點，即黃水體積分數20%、尿素添加量1.5 g/L及KCl添加量3 g/L。

表5 最陡爬坡試驗設計與結果Table 5 Design and results of the steepest ascent tests for medium components optimization

2.5 響應面法優化培養基成分

以KCl添加量（A），尿素添加量（B）黃水體積分數（C）為影響因素，絮凝率（Y）作為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行設計，Box-Behnken試驗設計結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 培養基成分優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests for medium components optimization

續表

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表6數據進行擬合，得到響應面二次回歸方程：Y=84.52+0.46A+0.96B-0.70C-0.50AB-1.73AC-0.38BC-6.09A2-5.37B2-3.83C2。模型的P值＜0.000 1，說明模型的二次擬合方程是高度顯著的，失擬項P值為0.379 6＞0.05，說明失擬因素不存在，該回歸方程可以用于初步分析和預測。一次項B、C對結果影響顯著（P＜0.05）、二次項A2、B2、C2和交互項AC對結果影響極顯著（P＜0.01）。

KCl添加量、尿素添加量和黃水體積分數各因素兩兩交互對絮凝率的影響結果見圖10。

由圖10a可知，三維曲面圖較為緩和，等高線呈較緩和的橢圓形，說明尿素與KCl添加量的交互作用相對較小。由圖10b可知，三維曲面圖最為陡峭，等高線呈明顯的橢圓形，說明黃水體積分數與KCl添加量交互作用相對顯著。由圖10c可知，三維曲面圖較為緩和，等高線呈較緩和的橢圓形，說明尿素添加量與黃水體積分數的交互作用相對較小。

通過軟件Design-Expert 8.0.6軟件分析得到最佳培養基成分為3.02 g/L KCl，1.52 g/L尿素，17.23%黃水，此時絮凝率理論值為84.6124%。結合試驗實際操作的可行性，將上述最優培養基組分修正為3.0 g/L KCl，1.5 g/L尿素，17%黃水。以響應面分析得到的最佳結果進行重復試驗3次，測得絮凝率實際平均值為84.35%，與理論值基本吻合。

圖10 KCl添加量、尿素添加量及黃水體積分數對絮凝率影響的響應面曲面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between KCl addition,urea addition and Huangshui volume fraction on flocculation rate

3 結論

通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗及響應面試驗結果表明，超壓腸桿菌產絮凝劑優化發酵條件為培養基初始pH值7，接種量6%，黃水體積分數為17%，葡萄糖添加量為7.5g/L、尿素添加量為1.5g/L、KCl添加量為3 g/L。在此最佳培養基條件下，絮凝劑的絮凝率可達到84.35%。該研究為超壓腸桿菌利用黃水培養基生產微生物絮凝劑的研究及應用奠定了理論基礎。