富硒長雙歧桿菌優勢菌株的高通量選育

張旭東，王 桃，王白鴿，李忠磊，陳代杰，譚 俊*

（1.上海醫藥工業研究院，上海 201203；2.上海師范大學 生命科學學院，上海 200234；3.上海交通大學 藥學院，上海 200240）

硒是人體必需的一種微量元素，對人類健康有非常重要的作用，缺硒會引發多種疾病（如大骨節病、克山病等），嚴重缺硒還會引起心肌病及心肌衰竭[1-2]。硒元素能參與合成硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸以及其他多種硒代蛋白（酶），具有抗腫瘤、抗氧化、調節免疫、增強抵抗力等生物學活性[3-6]。雙歧桿菌（Bifidobacterium）具有益生作用，是1899年由法國學者TISSIER從母乳喂養的嬰兒糞便中分離出的一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌[7-9]，被廣泛應用于各種食品（如牛奶、酸乳、嬰兒配方奶粉、谷物類食品、奶酪和膳食補充劑等[10-11]）中。

根據雙歧桿菌的生理代謝特點，通過雙歧桿菌的富硒化培養，將培養基中的無機硒轉化為菌體內更高生物利用度的有機硒，制成富硒雙歧桿菌的活菌制劑，不僅能夠利用硒的保健作用，還可以增加雙歧桿菌的穩定性與抗氧化能力，提高雙歧桿菌的活力[12-14]。世界衛生組織建議每天補充200 μg硒，可有效預防多種疾病的高發。富硒益生菌既可以滿足人們對益生菌的需求，又能增加產品有機硒含量，發揮了硒和益生菌的雙重功效[15-17]。

雙歧桿菌作為用于食品及藥品的益生菌，其優勢菌株的獲得不能誘變，只能通過自然選育，然而傳統的菌株選育方法工作量很大，不僅費時費力，且受到通量限制，大部分菌株由于沒有篩選機會而被流失了，因此很難篩選到符合要求的優勢菌株[18-21]。擴大篩選通量來減少隨機篩選的盲目性是一條可以大大提高育種效率的新途徑。本研究使用現有的通用低成本儀器設備，采用96孔深孔板微型化培養和酶標儀快速檢測，篩選富硒長雙歧桿菌優勢菌株，通過培養過程中流加亞硒酸鈉的方式，提高蛋白硒含量。硒對生命健康有極其重要的作用，開發富硒長雙歧桿菌產品，將無機硒轉化成毒性低和生物利用度高的有機硒，具有巨大的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌種

長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）DD98：由上海醫藥工業研究院實驗室提供。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；氯化鈉、無水乙酸鈉（均為分析純）：連云港冠蘇實業有限公司；氫氧化鈉（分析純）：濟南英出化工科技有限公司；葡萄糖（分析純）：西王藥業有限公司；低聚果糖（分析純）：鄧州萬博食品配料有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（分析純）：河南盛之德商貿有限公司；牛肉浸膏（生化試劑）、亞硒酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基：牛肉膏10.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，D（+）-葡萄糖5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，無水乙酸鈉3.0 g/L，瓊脂粉18.0 g/L，pH 6.8。

種子培養基：牛肉膏10.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，D（+）-葡萄糖5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，無水乙酸鈉3.0 g/L，pH 6.8。

發酵培養基：蛋白胨17.0 g/L，D（+）-葡萄糖22.0 g/L，酵母粉16.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，無水乙酸鈉3.0 g/L，低聚果糖4.0 g/L，pH 6.8。

上述培養基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BIOTECH-7BG發酵系統：上海保興生物設備工程有限公司；PB-10酸度計：德國賽多利斯公司；LQ-C30002電子天平：上海瑤新電子科技有限公司；MULTISKAN GO酶標儀：美國Thermo Scientific公司；CONCEPT 400M厭氧培養箱：英國RUSKINN公司；LGJ-22D冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高通量篩選流程

DD98菌株的分離純化→長雙歧桿菌優勢菌株的高通量初篩→長雙歧桿菌優勢菌株的高通量復篩→長雙歧桿菌優勢菌株的富硒馴化→富硒長雙歧桿菌優勢菌株的高通量篩選→7 L罐發酵驗證→菌株的穩定性考察

1.3.2 菌株DD98的活化

取一支菌株DD98的甘油管，等分至96深孔板各個孔中（每孔裝種子培養基1 mL），靜置在厭氧培養箱中，37 ℃培養，14 h 后檢測各孔OD600nm值，從OD600nm值最高的孔中取出一部分發酵液，梯度稀釋后涂布平板。將涂布好的平板倒置于厭氧培養箱中，37 ℃培養24 h，用牙簽挑選長勢較好的單菌落進行高通量初篩。

1.3.3 長雙歧桿菌優勢菌株的高通量初篩

用牙簽從平皿上挑選盡可能多的單菌落至96深孔板中，靜置在厭氧培養箱中，37 ℃培養14～16 h后，用8 道移液器取樣（200 μL/孔），進行酶標儀檢測（OD600nm值）。

1.3.4 長雙歧桿菌優勢菌株的高通量復篩

從高通量初篩菌株中挑選OD600nm值最高的24個孔進行復篩。按照5%（V/V）接種量接入已裝有1.2 mL種子培養基的96 孔板中，每組4個平行，靜置在厭氧培養箱中，37 ℃培養14 h后，用移液器取樣（200 μL/孔），進行酶標儀檢測（OD600nm值）。

1.3.5 菌株生長曲線的繪制

將菌株DD98與篩選得到的長雙歧桿菌優勢菌株分別接新鮮斜面，于厭氧培養箱37 ℃培養24 h，將斜面洗下至100 mL發酵培養基中，靜置在厭氧培養箱中，37 ℃培養，每隔一定時間取樣，稀釋涂布，待菌落長出后，活菌計數，繪制菌株生長曲線。

1.3.6 長雙歧桿菌優勢菌株的傳代穩定性考察

將長雙歧桿菌優勢菌株在新鮮斜面上連續5次傳代，將不同傳代次數的菌株分別進行搖瓶發酵，并對發酵液進行活菌計數，考察菌種的傳代穩定性。

1.3.7 富硒馴化

將復篩獲得的長雙歧優勢菌株進行富硒馴化。首先配制200 mg/mL亞硒酸鈉母液，過濾后保存在冰箱，使用時根據濃度設定添加一定體積的亞硒酸鈉母液到培養基中，再將培養基分裝至96深孔板（每孔裝量1.2 mL）或者平皿中。根據實驗經驗，設計富硒馴化梯度：5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、15.0μg/mL、20.0μg/mL、25.0μg/mL、30.0μg/mL。將長雙岐優勢菌株的甘油管按照0.8%（V/V）接種量接至含有5.0 μg/mL亞硒酸鈉種子培養基的96深孔板中（1.2 mL/孔），37 ℃靜置厭氧培養20～22 h，用移液槍取樣200 μL/孔，酶標儀檢測OD600nm值。挑選OD600nm值最高的孔進行10 μg/mL亞硒酸鈉濃度馴化，重復上述操作，直到亞硒酸鈉添加量達到30.0 μg/mL，挑選OD600nm值最高的孔，稀釋涂布到30.0 μg/mL亞硒酸鈉平皿上，37 ℃厭氧培養箱培養24 h，待單菌落長出后，用牙簽挑取盡可能多的個大且不紅的單菌落于96深孔板中，靜置在厭氧培養箱中，37 ℃培養14 h后，用移液器取樣（200 μL/孔），進行酶標儀檢測，OD600nm值高的幾個孔，分別接新鮮斜面，37 ℃靜置厭氧培養24 h后，用20%的甘油洗下斜面保種，編號并保藏。由于菌種退化問題，必要時菌種要復蘇進行第二輪、第三輪馴化。

1.3.8 7 L發酵罐發酵

將富硒長雙歧優勢菌株與馴化前菌株分別接于新鮮斜面上，培養24 h后分別接種于種子培養基中，37 ℃培養12 h，按照6%（V/V）接種量接至7 L發酵罐（裝量6 L）中。發酵罐溫度為37 ℃，NaOH調節pH穩定維持在6.5，發酵罐發酵12 h時，放掉3 L，開始進行補料同時補硒，控制流速，24 h補完，亞硒酸鈉質量濃度達到12.5 μg/mL，此時放掉部分發酵液，離心收集菌體并凍干，測菌體總硒含量及硒蛋白轉化率。留3 L繼續開始補料，同時取樣進行活菌計數。以同樣的速度，補料24h，補料結束時亞硒酸鈉質量濃度達到18.5μg/mL，放罐離心收集菌體并凍干，測菌體總硒含量及硒蛋白轉化率，同時取樣進行活菌計數。

1.3.9 分析檢測

（1）活菌計數

將待測樣品進行梯度稀釋，取100 μL加入固體平板上，用無菌涂棒將菌液涂布于整個平板表面，盡量將菌液涂干，每個稀釋度涂至少3個平板，37 ℃倒置厭氧箱中培養，待菌落長出后，計數。原菌液的活菌數（CFU/mL），即每毫升原菌液活菌數=同一稀釋度三個平皿菌落平均數×稀釋倍數×10

（2）菌株富硒量的測定

根據國標GB 5009.93—2010《食品中硒的測定》測定樣品的硒蛋白含量。

1.3.10 數據統計分析

實驗中每個處理結果至少重復3次，采用Excel 軟件分別對數據結果進行統計學誤差分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌優勢菌株的高通量選育

2.1.1 菌種的活化

表1 長雙歧桿菌DD98活化后的OD600nm值Table 1 OD600nmvalue of Bifidobacterium lonfidum DD98 after activation

由表1可知，各孔菌株生長存在一定差異：甘油管接到96深孔板中，于37 ℃厭氧箱中活化14～16 h后，大部分菌株的OD600nm值都處于0.35～0.45之間，A3孔長勢最好，OD600nm值達到0.528，因此，選擇A3孔進行稀釋涂布，挑選單菌落進行高通量初篩。

2.1.2 長雙歧桿菌優勢菌株的高通量初篩

高通量初篩結果見圖1。由圖1可知，挑選的將近800個單菌落中，大部分菌株的OD600nm值處于0.35～0.50之間，只有少數菌株的OD600nm值能夠超過0.60。選擇OD600nm值最高的48個菌株（0.55～0.70）進行復篩。

圖1 高通量初篩結果Fig.1 Results of high-throughput preliminary screening

2.1.3 長雙歧桿菌優勢菌株的高通量復篩

高通量復篩結果見圖2。由圖2可知，11#、12#、24#、48#孔OD600nm值最高，分別為0.650、0.680、0.681、0.678，將這4個菌株分別接新鮮斜面并甘油管保存。

圖2 高通量復篩結果Fig.2 Results of high-throughput secondary screening

2.1.4 菌株生長曲線的繪制

圖3 長雙歧桿菌DD98生長曲線Fig.3 Growth curve of Bifidobacterium longum DD98

長雙歧桿菌DD98的生長曲線見圖3。由圖3可知，0～12 h活菌數不斷增加，OD600nm值與活菌數呈一定對應關系；12～16 h活菌數增長速度減慢，而OD600nm值仍處于快速增長狀態；16 h時活菌數達到最大，之后活菌數有所下降，但16 h后OD600nm值則處于一個平穩的狀態。因此，選擇對數生長中期的14 h，作為高通量取樣檢測時間。高通量檢測方法使得大量樣品可同時檢測，不僅減少了檢測誤差，而且大大縮短了檢測時間。

2.1.5 發酵培養驗證

將11#、12#、24#、48#這4株優勢菌株與DD98菌株進行搖瓶發酵比較，結果見圖4。由圖4可知，12#菌的活菌數最多，由7.4×108CFU/mL 提高至5.73×109CFU/mL。經過5次傳代，活菌數仍穩定在5.0×109CFU/mL。因此，選擇12#優勢菌株進行富硒馴化，并編號為XBL-01。

圖4 搖瓶發酵活菌數檢測結果Fig.4 Determination results of the viable cells number in shake flasks

2.2 富硒長雙歧桿菌優勢菌株的高通量選育

2.2.1 富硒馴化及高通量篩選

對菌株XBL-01進行5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、15.0 μg/mL、20.0 μg/mL、25.0 μg/mL、30.0 μg/mL的亞硒酸鈉富硒馴化，每一次馴化完挑選OD600nm值最高的孔進行下一輪的富硒馴化，直到亞硒酸鈉添加濃度達到30.0 μg/mL，挑選OD600nm值最高的孔，稀釋一定梯度后，涂布到30.0 μg/mL 亞硒酸鈉平皿上，37 ℃厭氧培養箱培養24 h，待單菌落長出后，盡可能多的挑取個大且不紅的單菌落于裝有培養基的96深孔板中，37 ℃靜置厭氧培養20 h，酶標儀檢測。結果見圖5。

圖5 高通量篩選結果Fig.5 Results of high-throughput screening

由圖5可知，絕大部分菌株的OD600nm值處于0.30～0.50之間，只有少數菌株的OD600nm值能夠達到0.60以上。選擇長勢最好的菌株，編號為XBL-30接新鮮斜面，甘油管保藏，用于7 L罐富硒發酵培養。本研究建立的微型化培養方法，將傳統的搖瓶初篩和搖瓶復篩縮小在96孔深孔板中進行，先篩選出具有明顯生長優勢的混合菌群，再進一步從菌群中分離單菌落，然后結合高通量檢測篩選到優勢菌株，大大增加了篩選通量，提高了工作效率。

2.2.2 富硒長雙歧桿菌優勢菌株的穩定性考察

將富硒長雙歧優勢菌株XBL-30于新鮮斜面上連續傳代5次，分別進行搖瓶發酵驗證，活菌計數分別為1.57×109CFU/mL、1.76×109CFU/mL、1.52×109CFU/mL、1.69×109CFU/mL、1.55×109CFU/mL，菌株XBL-30具有較好的遺傳穩定性，可用作下一步7 L罐發酵，同時也證實了高通量篩選方法具有可行性。

2.2.3 7 L罐富硒發酵培養

富硒長雙歧優勢菌株XBL-30與未富硒馴化的XBL-01菌株，通過流加補硒的方式，發酵結束后，分別離心收集菌體，凍干成富硒菌粉，測定菌粉的活菌數及硒蛋白含量，結果見圖6。

圖6 菌株XBL-30及菌株XBL-01 7 L罐發酵結果對比Fig.6 Comparison of fermentation results of strain XBL-30 and XBL-01 in 7 L fermentor

由圖6可知，未富硒馴化的XBL-01菌株活菌數為1.12×109CFU/mL，硒蛋白轉化率為60.9%；而富硒長雙歧優勢菌株XBL-30活菌數為4.94×109CFU/mL，硒蛋白轉化率提高到85.3%。此結果也進一步證實高通量篩選方法具有可行性。

3 結論

本研究采用96深孔板微型化培養方法，先篩選出具有生長優勢的混合菌群，再進一步從菌群中分離單菌落，然后結合高通量檢測篩選出優勢菌株，大大降低了篩選工作量，減輕育種工作者的負荷。此外，采用梯度壓力馴化結合高通量篩選的方法，成功篩選到富硒長雙歧桿菌優勢菌株XBL-30，并對其進行7 L發酵罐富硒培養，在亞硒酸鈉添加質量濃度為18.5 μg/mL時，硒蛋白轉化率達到85.3%。本研究建立的高通量篩選方法具有可行性，對其他益生菌等菌株的大規模篩選具有重要的參考價值。