響應面法優化金銀花枸杞風味酸奶的發酵工藝

成 堃，袁雪嬌，高 星，蔡曉明，井海榮

（齊魯理工學院 化學與生物工程學院，山東 濟南 250200）

金銀花（Lonicera japonica）又名忍冬，是清熱解毒、疏散風熱的良藥，具有抑菌、保肝、抗氧化等藥理活性[1-3]。2002年，原衛生部印發了《既是食品又是藥品的物品名單》，明確了金銀花屬于藥食兩用物質。以金銀花為原料研發的保健飲品兼具消暑解渴和保健的功效，如金銀花菊花甘草復合保健涼茶[4]、魚腥草金銀花涼茶[5]、決明子枸杞金銀花復合飲料[6]等。

枸杞是傳統的名貴中藥材，藥食兩用，具有多種藥用與營養價值[7]，在飲料、保健飲品、食品中有重要的用途。目前以枸杞為原料開發的產品有枸杞山藥百合復合飲料[8]、枸杞覆盆子果醋[9]、枸杞桂圓復合飲料[10]、枸杞菠蘿復合果酒[11]、靈芝枇杷花復方口服液[12]、桃膠枸杞新型營養果凍[13]等。

風味酸奶營養豐富，口味多樣，尤其受到兒童、學生、都市白領等年輕消費人群的喜愛。已經報道的風味酸奶中，根據原料的不同，主要有水果酸奶、谷物酸奶、蔬菜酸奶等。中藥是我國古代科學的瑰寶，以藥食兩用中藥為原料開發的酸奶日益增多。如方芳等[14]用蘆根、蓮子心、百合、雞內金、天冬研制出一種功能性酸奶，極大的提高了酸奶的品質；趙翾等[15]開發出一款火麻仁中藥型酸奶，具有通便潤腸、維持腸道菌群平衡、預防便秘的功能；張建萍等[16]研制的白果山楂酸奶營養豐富，具有開胃消食等功效。

本研究以金銀花、枸杞為原料，利用響應面法優化了金銀花枸杞風味酸奶的發酵工藝條件，不僅增加了風味酸奶的品種，也為金銀花的開發利用提供了一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉、枸杞、白砂糖：市售；金銀花：購于中藥店；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：齊魯理工學院化學與生物工程實驗教學中心保藏。

1.2 儀器與設備

美的WBL2521H榨汁機：廣東美的生活電器制造有限公司；HHW.21電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；GNP-9050型隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花枸杞風味酸奶發酵工藝

全脂奶（10%）→配料（金銀花汁，枸杞汁，白砂糖）→預熱，均質→殺菌（90 ℃，10 min）→冷卻（室溫）→接種→發酵（42 ℃，5 h）→冷藏后熟（4 ℃，12 h）→成品

1.3.2 操作要點

（1）金銀花汁、枸杞汁的制備

稱取5 g金銀花，加入100 mL蒸餾水，電磁爐上煎煮30 min；冷卻后紗布過濾，用少量水多次洗藥渣后收集濾液，定容至100 mL。

稱取10 g枸杞，用100 mL自來水浸泡過夜，榨汁機打漿，紗布過濾得濾液。

（2）母發酵劑的制備[17]

用接種針挑取保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的適量菌體，分別接入MRS液體培養基試管中，37 ℃培養2 d，調整培養液的菌濃至1×106個/mL。將全脂奶（10%）分裝試管、三角瓶，115 ℃保溫30 min。向試管中接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的菌懸液各1 mL，42 ℃培養至全脂奶出現凝乳；然后按照10%的接種量向三角瓶中接入上述培養物，42 ℃培養至全脂奶酸度為70～75°T，作為母發酵劑[17]。

1.3.3 金銀花枸杞風味酸奶發酵工藝的單因素試驗

選取金銀花汁添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、枸杞汁添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、發酵溫度（38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃）、發酵時間（3 h、5 h、7 h、9 h、11 h）、發酵劑接種量（5%、10%、15%、20%、25%）進行單因素試驗，每組試驗做3次重復試驗，結果取平均值。以感官評分、酸度為評價指標，確定各因素對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，選擇發酵溫度（A）、發酵時間（B）、發酵劑接種量（C）為自變量，以感官評分（Y）為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件，進行發酵工藝條件的響應面優化試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 金銀花枸杞風味酸奶發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of honeysucklewolfberry flavor yoghurt

1.3.5 質量指標

（1）金銀花枸杞風味酸奶的感官質量品評

金銀花枸杞風味酸奶的感官質量品評評分標準見表2。評價指標包括色澤、組織狀態、口感、氣味四項。感官品評小組由10人組成，根據評價標準，對風味酸奶打分，平均值作為風味酸奶的得分。

表2 金銀花枸杞風味酸奶感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt

（2）各指標的檢測

脂肪含量、蛋白質含量、酸度、乳酸菌數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母、霉菌等指標均按照國標GB 19302—2010《發酵乳》進行檢測[18]。

1.3.6 統計分析

應用Excel軟件進行試驗數據處理，利用Design-Expert version 8.0.6設計軟件進行響應面試驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 金銀花汁添加量對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響

圖1 金銀花汁添加量對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響Fig.1 Effect of honeysuckle juice addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同金銀花汁添加量發酵的酸奶感官評分和酸度見圖1。由圖1可知，添加有金銀花汁的酸奶均黏稠，同時有少量乳清析出。當金銀花汁添加量為5%、10%時，酸奶呈乳白色，口感酸，有淡淡的中藥味，金銀花汁添加量10%的酸奶比5%的略苦；當金銀花汁添加量超過15%時，酸奶顏色由淡黃色逐漸變為黃色，中藥味依次變濃，其中25%的酸奶中藥味最濃，口感最苦。總體上看，添加金銀花汁后，酸奶的酸度變化較小，且只有添加5%金銀花汁發酵出的酸奶有淡淡的酸奶香，口感最好。因此，金銀花汁的最適添加量為5%。

2.1.2 枸杞汁添加量對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響

圖2 枸杞汁添加量對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響Fig.2 Effect of wolfberry juice addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同枸杞汁添加量發酵的酸奶感官評分和酸度見圖2。由圖2可知，當枸杞汁添加量為2%時，酸奶顏色呈乳白色，隨著枸杞汁添加量的增加，酸奶顏色逐漸變紅，當枸杞汁添加量為10%時，酸奶顏色為淡紅色。添加了枸杞汁的酸奶均黏稠、細膩均勻無乳清析出；從風味上看，當枸杞汁添加量為6%時，酸奶香氣最協調、濃郁；隨著枸杞汁添加量的提高，口感依次變酸，添加10%時口感最酸，不協調。綜合色澤、組織狀態、口感、氣味等特征，枸杞汁的最適添加量為6%。

2.1.3 白砂糖添加量對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響

圖3 白砂糖添加量對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響Fig.3 Effect of sugar addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同白砂糖添加量發酵的酸奶感官評分和酸度見圖3。由圖3可知，白砂糖一方面作為碳源為微生物生長代謝提供營養物質，同時也作為甜味劑調節酸奶的口感，使發酵出的酸奶酸甜可口。從試驗結果看，添加了白砂糖發酵出的酸奶細膩且質地均勻黏稠，酸度變化很小；就口感而言，白砂糖添加量為2%時，酸奶酸味重；當白砂糖添加量為4%、6%時，口味比2%的略好，但是味道寡淡；當白砂糖添加量為8%時，酸甜可口；白砂糖添加量為10%時，酸奶甜味重。因此，白砂糖的最適添加量為8%。這與楊國浩等[19-20]的報道結果相同。

2.1.4 發酵溫度對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響

圖4 發酵溫度對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同發酵溫度發酵的酸奶感官評分和酸度見圖4。由圖4可知，發酵溫度為38 ℃、40 ℃時，發酵溫度略低，酸奶口味偏甜，呈奶液狀，不夠黏稠；當發酵溫度為42 ℃時，酸奶細膩黏稠，酸甜適中，發酵奶香中帶有淡淡的中藥香，感官評分最高；發酵溫度為44 ℃時，酸奶有少量的結塊，酸甜不適口；發酵溫度為46 ℃時，酸奶質地不均勻，有大量乳清析出，酸味較重。綜合感官評分和酸度，確定最適發酵溫度為42 ℃。

2.1.5 發酵時間對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響

圖5 發酵時間對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同發酵時間發酵的酸奶感官評分和酸度見圖5。由圖5可知，當發酵時間為3 h時，發酵時間過短，酸奶呈奶液狀，無發酵乳香，口感甜；發酵時間為5 h時，酸奶質地均勻，細膩黏稠，感官評分最高；隨著發酵時間的延長，酸奶的酸度升高，口感逐漸變酸；當發酵時間超過9 h時，酸奶酸味重，有大量乳清析出。因此，最適發酵時間為5 h。

2.1.6 發酵劑接種量對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響

圖6 發酵劑接種量對金銀花枸杞風味酸奶質量的影響Fig.6 Effect of starter inoculum on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同發酵劑接種量發酵的酸奶感官評分和酸度見圖6。發酵劑接種量為5%、10%、15%時，酸奶均細膩均勻無雜質，發酵劑接種量為5%時，酸奶口味淡薄；接種量為10%時，口感略甜；接種量為15%時，酸甜可口，口味協調，接種量超過20%時，有大量豆腐腦狀蛋白沉淀，口感粗糙有雜質；因此，發酵劑最適接種量為15%。

2.2 響應面法優化工藝條件

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果，使用Design-Expert 8.0.6軟件，以感官評分（Y）為響應值，選擇發酵溫度（A）、發酵時間（B）、發酵劑接種量（C）為自變量，設計了3因素3水平響應面試驗組，試驗設計與結果見表3，顯著性檢驗和方差分析結果見表4。

表3 金銀花枸杞風味酸奶發酵工藝優化響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of yoghurt

2.2.2 模型的建立及方差分析

用Design-Expert 8.0.6軟件將模型進行分析，得到金銀花枸杞風味酸奶的感官評分以及所選3個因素編碼值的回歸方程為：

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4知，失擬項P=0.839 5，說明相對于純誤差失擬不顯著（P＞0.05）。模型P＜0.000 1說明模型極顯著。獲得模型決定系數R2=0.998 1，說明該模型99.81%的數據可用此方程解釋。模型的變異系數（coefficient of variation，CV）相對較低（0.60%），說明該實驗值有很高的精密度及可靠性。綜上所述，該模型擬合度符合數理統計學原則，金銀花枸杞風味酸奶的工藝可以用此方程預測。根據F值的大小，得出金銀花枸杞風味酸奶感官評分受各因素的影響次序為：發酵劑接種量（C）＞發酵溫度（A）＞發酵時間（B）。除了二次項C2對感官評分無顯著影響外，其他項A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2對金銀花枸杞風味酸奶的感官評分影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.3 響應面分析與最優工藝驗證

利用Design-Expert 8.0.6軟件，作出以感官評分為響應值的各因素的響應曲面圖和等高線圖，并分析各因素的交互作用，結果見圖7。由圖7可知，發酵溫度（A）與發酵時間（B）、發酵溫度（A）與母發酵劑接種量（C）、發酵時間（B）與母發酵劑接種量（C）的橢圓度都很大，說明AB、AC、BC的交互影響都極顯著（P＜0.01）；綜合分析發現，發酵溫度（A）與發酵時間（B）的交互影響最顯著。

圖7 發酵溫度、發酵時間與母發酵劑接種量交互作用對金銀花枸杞風味酸奶感官評分影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,time and starter inoculum on sensory score of honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt

由軟件分析得金銀花枸杞風味酸奶的最優發酵工藝條件為發酵時間5.08 h，發酵溫度42.72 ℃，母發酵劑接種量10%；在該最優條件下，酸奶的感官評分預測值為91.31分。考慮到實際生產，將最優發酵工藝條件參數調整為發酵時間5.1 h、發酵溫度43 ℃、發酵劑接種量10%。按優化的發酵條件進行3次重復試驗，結果取平均值，得到酸奶的感官評分實際值為91分，說明最優發酵工藝條件可靠。

2.3 產品指標

發酵出的金銀花枸杞風味酸奶呈淡橙色，凝乳均勻，細膩無雜質；酸甜可口；酸奶有金銀花特有的藥香。蛋白質含量為2.3 g/100 g，脂肪含量為2.6 g/100 g，酸度為76°T。

金銀花枸杞風味酸奶中乳酸菌數為1.1×106CFU/mL，未檢出大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌，霉菌數＜1 CFU/mL，酵母數＜1 CFU/mL。

3 結論

通過單因素試驗優化了金銀花枸杞風味酸奶的配方，響應面法優化了金銀花枸杞風味酸奶的發酵工藝條件。結果表明，金銀花汁添加量為5%，枸杞汁添加量為6%，白砂糖添加量為8%，發酵溫度為43 ℃，發酵時間為5.1 h，母發酵劑接種量為10%。在此工藝條件下，發酵出的金銀花枸杞風味酸奶感官評分為91分，酸度為76°T。金銀花枸杞風味酸奶色澤均勻，酸甜適口，質地細膩，有金銀花特有的藥香，感官指標、理化指標和微生物指標均符合國家標準。