龍山豆豉細菌多樣性分析及其與當陽豆豉差異性比較

王 強，王玉榮，陳江紅，張振東，蔡 偉，郭 壯

（湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053）

豆豉是黑豆或黃豆等在細菌、真菌以及酶的作用下發酵而成的一類特色食品[1]。據記載，豆豉在我國的制作歷史可追溯至秦漢時期，目前在我國湖南、湖北、四川、重慶、云南和貴州等地依然保留著制作和食用豆豉的習慣[2]。傳統發酵豆豉制作方法較為粗放，產品品質除受原料和工藝的影響外，環境中的微生物對豆豉滋味、氣味、色澤和營養成分的形成也發揮著獨特的作用[3-5]。

杜霞等[6-7]采用傳統方法從江西發酵型豆豉和貴州三穗細菌型豆豉中均分離出芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株；任璐等[8]從永川和三臺毛霉型豆豉中分離出產β-葡萄糖苷酶、纖維素酶和蛋白酶能力不同的2株總狀毛霉（Mucor racemosus）；LIU C J等[9]采用分離純化的方法從云南省六個不同地區采集的30份傳統發酵咸豆豉中分離出隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）和芽孢桿菌屬等不同細菌屬的226株菌株。這些研究均采用的是基于純培養的微生物學分離鑒定方法，易受微生物種類、操作方法及培養條件的限制而不能全面反映豆豉中微生物多樣性。近年來，聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gel gradient electrophoresis，PCR-DGGE）和高通量測序等非培養技術因具有操作簡單、結果準確、直觀的特點逐漸被應用到豆豉微生物多樣性的研究中。CHEN T等[10-11]分別使用DGGE和高通量測序技術對江西地區豆豉中微生物進行研究，發現其內細菌主要為乳酸球菌屬（Lactococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和乳桿菌屬，真菌主要為橫梗霉屬（Lichtheimia）；CHEN C等[12]采用PCR-DGGE技術研究發現，吉林地區豆豉中的優勢菌屬為芽孢桿菌屬。

為了進一步探討不同地區產豆豉細菌多樣性的差異，本研究從湖南省湘西土家族苗族自治州龍山縣采集了5份細菌型豆豉，在前期研究[13]基礎上，使用Illumina MiSeq高通量測序技術對其中的細菌多樣性及群落結構組成進行解析，并采用多元統計學手段對其與當陽豆豉細菌多樣性間的差異進行分析，以期為后續細菌型豆豉微生物研究提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

龍山豆豉：采集自湖南省湘西土家苗族自治州龍山縣（109°10′～110°53′E，28°45′～29°30′N），共5份，編號為LSDC1、LSDC2、LSDC3、LSDC4和LSDC5。所有的豆豉均為細菌型豆豉，制作時間為25～30 d。采樣時取30 g左右樣本分裝于無菌離心管中運回實驗室，并置于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 化學試劑

QIAGEN脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphates，dNTPs）Mix、5×Trans StartTM、高保真DNA聚合酶（5 U/μL）、Fast Pfu Buffer：北京全式金生物技術有限公司；DNA 1000分析試劑盒：美國Agilent公司；111860瓊脂糖：香港基因有限公司；DL 15 000 DNA Marker、6×Lodding Buffer：武漢天一輝遠生物科技有限公司；DP214通用型DNA純化回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

DW-86L626醫用低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ABI Veriti 96孔梯度PCR儀：美國Applied Biosystems公司；DCodeTMSystem梯度凝膠電泳儀、PowerPacTMBasic穩壓穩流儀、UVP CDS-8000凝膠成像分析系統：美國Bio Rad公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Thermo公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；MiSeq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；HBM-400B拍擊式無菌均質器：天津市恒奧科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龍山豆豉樣本前處理及總DNA提取

取豆豉樣品10 g加入40 mL無菌蒸餾水，使用拍擊器拍擊5 min后在4 ℃、300 r/min條件下離心10 min，去除雜質，取上清液。采用DNA基因組提取試劑盒提取樣本的總DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整度。

1.3.2 16S rDNA基因的PCR擴增及測序

以檢測合格的DNA為模板，338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）為引物進行PCR擴增，PCR擴增體系和程序參照YANG F等[14]的方法并略作改動。PCR擴增體系：模板10 ng，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5×PCR Buffer 4 μL，5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL，5 U/μL DNA 聚合酶0.4 μL以及無菌雙蒸水（ddH2O）11 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共循環30次；72 ℃再延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行測定，將合格的產物進行清潔后使用Illumina Miseq系統進行測序。

1.3.3 生物信息學分析

參照文獻[15]的方法將從Illumina MiSeq平臺中獲得的成對序列合成一條完整序列，根據相應標記將各序列分配至不同樣本中，然后切除正反引物并進行序列質量控制。將質控合格的有效序列上傳至QIIME（V1.9.1）分析平臺[16]，使用兩步UCLUST算法[17]分別根據100%和97%相似度為標準將序列歸類至不同的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）中，然后挑選代表性序列與Greengenes數據庫[18]進行比對，明確其微生物學分類地位。

將平均相對含量＞1.0%的細菌門或屬定義為優勢細菌門或優勢細菌屬，將在各樣品中均存在的細菌屬或OTU定義為核心細菌屬或核心OTU，未鑒定出的序列定義為unclassifiled。

1.3.4 數據處理

使用主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）等Beta多樣性指數分析龍山豆豉與當陽豆豉細菌差異性；利用R3.5.0中的ggplot和reshape包對龍山豆豉優勢細菌門和屬進行分析并繪制優勢細菌門屬相對含量圖；使用Origin 2017繪制核心OTU相對含量堆積柱狀圖及龍山和當陽兩組豆豉差異箱型圖，并使用曼惠尼（Mann-Whitney）分析中的蒙特卡羅置換檢驗（Monte Carlo permutation test）判斷兩組樣本差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 龍山豆豉細菌多樣性分析

通過質控，從5個龍山豆豉樣本中共檢測出326 820條高質量序列，平均每個樣品65 364條序列。在100%序列相似性下，采用UCLUST算法將所有序列劃分為162 887個OTU，在97%序列相似性下又進一步將所有序列歸入15 641個OTU，經比對這些OTU可劃分為18個門、49個綱、75個目、148個科以及249個屬。

2.2 龍山豆豉細菌群落結構分析

2.2.1 基于門水平龍山豆豉細菌群落結構分析

圖1 龍山豆豉樣品中優勢細菌門及其相對含量Fig.1 Dominant bacteria phyla and its relative content in Longshan douchi samples

由圖1可知，龍山豆豉中的優勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中，Firmicutes的平均相對含量（77.43%）最高，占絕對優勢。除含有較多的Firmicutes外，樣品LSDC2中含有41.48%的細菌隸屬于Proteobacteria，樣品LSDC3中有26.91%的細菌隸屬于Actinobacteria，且在樣品LSDC2中，Proteobacteria的相對含量高于Firmicutes（35.98%）。值得一提的是，在樣品LSDC5中僅檢測出兩個細菌門，即Firmicutes和Proteobacteria，相對含量分別為99.99%和0.01%，說明在龍山豆豉發酵過程中起主導作用的細菌隸屬于厚壁菌門。

2.2.2 基于屬水平龍山豆豉細菌群落結構分析

圖2 龍山豆豉樣品中優勢細菌屬及其相對含量Fig.2 Dominant bacteria genera and its relative content in Longshan douchi samples

由圖2可知，龍山豆豉樣品中的優勢細菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebac-terium）、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）和Bavariicoccus，其平均相對含量分別為21.46%、15.83%、8.69%、8.38%、7.62%、7.14%、6.69%、4.65%、1.19%、1.10%。其中Bacillus、Pediococcus和Staphylococcus為核心優勢細菌屬。不同樣品中各優勢細菌屬的相對含量不同，樣品LSDC1中以Staphylococcus和Bacillus為主，樣品LSDC2中以Pseudomonas為主，樣品LSDC3中以Weissella和Corynebacterium為主，樣品LSDC4中以Weissella和Pediococcus為主，特別地，樣品LSDC5中Bacillus的相對含量高達83.47%，占絕對優勢。各樣品中不可鑒定到屬水平的序列的相對含量較為相近，平均相對含量為9.55%，說明龍山豆豉中仍有大量細菌未被發掘。李世瑞等[19]采用454焦磷酸測序技術分析采集自湖南的曲霉型豆豉不同發酵階段細菌多樣性，發現Weissella、Bacillus、Staphylococcus、Lactococcus、Enterococcus和Pseudomonas都有檢測出，與本研究結果較為相似。

豆豉樣品中的核心OTU有12個，僅占OTU總數的0.08%，而其包含的序列有43 069條，占總序列數的13.18%，說明龍山豆豉中含有較多核心菌群。因此，進一步對核心OTU分類及其在各樣品中的分布情況進行分析，結果見圖3。

圖3 豆豉樣品中核心OTU及其相對含量Fig.3 Core OTU and its relative content in Longshan douchi samples

由圖3可知，12個核心OUT為OTU13900、OTU9433、OTU14842、OTU1238、OTU6072、OTU8697、OTU12939、OTU7293、OTU436、OTU8673、OTU2592和OTU15057，其主要為隸屬于Firmicutes 的Bacillus、Enterococcus、Lactobacillus、Staphylococcus和Weissella，隸屬于Proteobacteria的腸桿菌屬（Enterobacter）和Pseudomonas，以及隸屬于Actinobacteria的假桿菌屬（Pseudoclavibacter）。核心OTU在各樣品中的分布差異較大，樣品LSDC1中的OTU8673（Staphylococcus）、樣 品LSDC2 中 的OTU436（Pseudomonas）、樣 品LSDC4中的OTU1238（Enterobacter）和樣品LSDC5 中的OTU13900（Bacillus）的相對含量明顯高于其他樣本，這與圖1和圖2分析結果基本一致。樣品LSDC1～LSDC5中，核心OTU占各樣品中OTU總數的比例分別為0.27%、0.23%、0.27%、0.29%和0.59%，其所包含的序列在各樣本中的累積相對含量分別為23.19%、9.90%、4.92%、10.77%和17.48%，說明不同樣品中除含有大量核心細菌外還含有多種特有細菌菌群。

2.3 龍山豆豉與當陽豆豉間細菌差異性分析

有研究表明，地理因素對豆豉中微生物豐度可能存在一定影響[20]。采用基于UniFrac距離矩陣的主坐標分析對采集自湖南龍山和湖北當陽的豆豉進行分析，結果見圖4。

圖4 基于非加權（A）和加權（B）UniFrac距離兩個地區豆豉樣品細菌菌群主坐標分析結果Fig.4 Principal coordinates analysis results of bacterial community in douchi samples from two regions based on unweighted (A)and weighted (B) UniFrac distance

由圖4可知，當不考慮各樣本中的菌群豐度時（圖4A），第一和第二主成分的貢獻率分別為32.34%和14.13%，龍山豆豉樣本（LSDC1～LSDC5）分布在第一、三和四象限，且除樣品LSDC5外，其他樣本較集中，而當陽豆豉樣本（DC1～DC6）全部分布在第二象限，在PC1維度上能將當陽豆豉與除LSDC5以外的龍山豆豉樣本很好的區分開，兩個地區樣本間無交疊現象。將細菌在各樣本中的相對含量納入考慮范圍對樣本差異進行分析時（圖4B），第一主成分的貢獻率為63.77%，第二主成分的貢獻率為27.75%，二者累積貢獻率高達91.52%，龍山豆豉樣本較非加權的算法更為分散，在四個象限中均有分布，而當陽豆豉樣本更為集中，仍只分布在第二象限，兩類樣本間有交疊部分。說明兩類豆豉樣本細菌群落結構存在差異，且龍山豆豉樣本間距離比當陽豆豉樣本間距離更大。進一步使用基于UniFrac的UPGMA對樣本間距離遠近進行分析，結果見圖5。

圖5 兩地區豆豉樣本UPGMA分析結果Fig.5 UPGMA analysis results of douchi samples from two regions

由圖5可知，龍山豆豉樣品中除樣品LSDC3和LSDC4外，其余樣本各據一個分支，且樣品LSDC2的分支長度最長，樣品LSDC1和LSDC5較近，說明樣品LSDC2與其他樣本間距離最遠，這與圖4（B）分析結果一致。由圖5可知，當陽豆豉全部集中在聚類樹末端且各樣本分支長度遠小于龍山豆豉，這說明龍山豆豉樣本間距離要大于當陽豆豉，為了對這一結論進行驗證，對兩個地區豆豉樣品間的差異性進行分析，結果見圖6。

圖6 兩個地區豆豉樣品間差異性分析結果Fig.6 Difference analysis results of douchi samples from two regions

由圖6可知，龍山豆豉各樣本間的距離為0.39±0.09，當陽豆豉各樣本間的距離為0.03±0.01，表明龍山豆豉組內各樣本細菌群落結構差異性要比當陽豆豉組內差異性大。采用Mann-Whitney分析中的Monte Carlo permutation test發現，兩組樣本差異極顯著（P＜0.01）。本研究進一步對不同地區豆豉中優勢細菌屬相對含量的差異性進行了分析，結果見圖7。

由圖7可知，兩個地區豆豉中優勢細菌屬共有10個，分別為Bacillus、Weissella、Staphylococcus、Pediococcus、Corynebacterium、Enterococcus、Pseudomonas、Leuconostoc、Aneuri-nibacillus和Bavariicoccus，其在龍山豆豉樣品中的平均相對含量分別為（21.46±35.80）%、（15.83±11.49）%、（8.38±15.38）%、（8.69±10.72）%、（7.62±9.86）%、（7.14±6.72）%、（6.69±14.37）%、（4.65±5.09）%、（1.19±2.66）%和（1.10±1.17）%，其在當陽豆豉中的平均相對含量分別為（95.26±5.33）%、（0.23±0.51）%、（1.12±2.07）%、（0.30±0.73）%、（0.43±0.79）%、（0.06±0.12）%、（0.02±0.03）%、（0.01±0.02）%、（0.02±0.04）%和0。除Bacillus外，其余9個細菌屬在龍山豆豉中的平均相對含量都遠高于當陽豆豉，其中Bacillus、Pediococcus和Bavariicoccus在兩組樣本中的分布情況差異極顯著（P＜0.01）。代表龍山豆豉各細菌屬分布的箱體總體較為狹長，最小值與最大值之間相隔較遠，與之相比，代表當陽豆豉細菌屬分布的箱體更為集中。表明龍山豆豉細菌多樣性較高且個體間差異性較大，而當陽豆豉樣本間細菌多樣性差異性更小。造成兩地區豆豉細菌群落結構差異的主要細菌屬為Bacillus、Pediococcus和Bavariicoccus。

圖7 兩地區豆豉樣品間差異分析箱型圖Fig.7 Box diagram of difference analysis of douchi samples from two regions

3 結論

通過本研究發現龍山豆豉的優勢細菌門有5個，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes），且Firmicutes為核心菌門；優勢細菌屬有10個，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）和Bavariicoccus，平均相對含量分別為21.46%、15.83%、8.69%、8.38%、7.62%、7.14%、6.69%、4.65%、1.19%和1.1%。樣本中的核心細菌屬為Bacillus、Pediococcus和Staphylococcus構成。龍山豆豉樣本間細菌差異性要大于當陽豆豉樣本間差異，且兩地區樣本間細菌多樣性差異極顯著（P＜0.01），在兩類樣本的優勢細菌屬中Bacillus、Pediococcus和Bavariicoccus是造成其細菌群落結構差異的主要細菌屬。