生料與熟料發酵生產食醋的分析研究

車有榮 ，李文濤，牛擁軍，霍衛寧，宋靈俊，張 欣，劉傳剛，王正剛

（1.北京六必居食品有限公司，北京 101400；2.定州市富元調味品有限公司，河北 定州 073000；3.北京市食品科學研究院，北京 100068；4.山西東湖老陳醋集團，山西 太原 030000）

北京龍門米醋始創于清嘉慶二十五年（1820年），醋廠原稱龍門醋坊，1993年國內貿易部正式授予北京市龍門醋廠“中華老字號”稱號。龍門米醋以優質大米為主要原料，在20世紀70年代，釀造工藝改為生料直接發酵制醋后，產品質地純正、呈紅棕色或琥珀色、體態澄清、酸味柔和，入口微甜，深受全國各地消費者的歡迎，在全國同行業中享有較高聲譽。隨著多年實踐摸索，龍門醋廠的前稀后固生料發酵制醋工藝[1-2]，逐漸成熟并廣泛應用于食醋發酵行業。其與傳統熟料制醋[3]在工藝上的區別主要是原料無需經過高溫蒸煮處理，糖化、酒精發酵過程在發酵池中同時進行。生料制醋（原料不經蒸煮）與熟料制醋（原料經蒸煮）相比，具備以下優點：工序少、耗能低、出品率高、風味好且穩定。

電子鼻是由氣味傳感器、數據處理設備和分析軟件等組成的設備，通過模擬人嗅覺系統對樣品進行捕獲和檢測，可以分析、識別、檢測負責氣味和揮發性成分。1998年，電子鼻技術首次被應用于食醋，成功區分出不同年份的意大利香酯醋[4]。近年來，電子鼻技術在食品中的應用逐漸廣泛[5]，如在醬[6-8]、醬油[9-10]、食醋[11-15]的發酵過程監控和不同產品的區分等。電子舌是一種利用多傳感陣列為基礎，感知樣品的整體特征響應信號，對樣品進行模擬識別和定量定性分析的一種檢測技術。電子舌技術也廣泛應用于有效識別醬油[16]，食醋的品質鑒定和區分[17-20]，分析山西老陳醋發酵過程[21]等。但目前，全面系統地將生料與熟料制醋發酵工藝進行對比研究，以及不同發酵和陳釀工藝對食醋風味的影響方面研究較少。

本研究同時進行生料和熟料兩種發酵工藝生產食醋，并定期檢測其理化酒精、總酸、還原糖和不揮發酸含量，通過電子鼻和電子舌分析系統分別進行醋酸發酵過程和醋液陳釀過程中氣味和滋味的檢測分析，并運用主成分分析（principle component analysis，PCA）對氣味數據進行處理分析。對比分析生料發酵制醋工藝與熟料發酵制醋工藝在食醋風味方面的差異，明晰原料蒸煮工藝對醋酸發酵過程中理化指標和香氣滋味形成的影響，以及在陳釀后兩種工藝生產食醋的風味差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

大米粉、麩皮、稻殼和大曲：定州市富元調味品有限公司，其中大曲糖化力976 U/g，麩皮含淀粉47.60%，大米含淀粉73.56%；耐高溫活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；糖化酶制劑（100 000 U/g）和淀粉酶制劑（20 000 U/g）：杰諾生物酶有限公司。

1.1.2 化學試劑

氫氧化鈉、鹽酸、酚酞、亞甲藍、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、體積分數95%乙醇（均為分析純）：北京化工廠；葡萄糖標準品（純度≥99%）：天津市福晨化學試劑廠；實驗用水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水》中規定的三級水。

1.2 儀器與設備

PEN3型電子鼻分析系統：德國AIRSENSE公司；SA402B電子舌分析系統：日本INSENT公司；精密酒精計：冀州市耀華器械儀表廠；PB-10酸度計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；XPR電子精密天平（感量0.1 mg）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PWN124ZH電子天平（感量0.01 g）：常熟雙杰測試儀器廠；電熱恒溫水浴鍋DK-98-IIA：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗方法

測試樣品均是取自同一批次，于不同發酵池中同時發酵，取樣分析。每發酵池主料（大米粉）800 kg，其它輔料的添加量以主料計，配方見表1。生料發酵實驗3個發酵池，即生料110#、111#和112#；熟料發酵的糖化和酒精發酵在兩個發酵罐2#和4#中進行，醋酸發酵實驗3個發酵池，即熟料113#、114#和115#。在糖化和酒精發酵過程中，每天取醪液檢測理化指標；在醋酸發酵和陳釀過程中，每兩天取醋樣檢測理化指標；在醋酸發酵一周、兩周和三周時取醋樣進行風味檢測，對醋酸發酵結束后的原醋汁和淋醋樣分別取醋樣檢測風味物質；在分別經室內1個月、室內2個月、曬制1個月和曬制2個月處理后的陳釀醋樣取樣進行風味檢測分析。

表1 生料和熟料發酵工藝配方Table 1 Formula of raw materials and clinker fermentation process%

1.3.2 工藝流程

（1）生料發酵工藝流程

工藝要點：

糖化：將磨好的大米粉、大曲、底麩等按比例添加到預先放好水的不銹鋼罐中，邊攪拌邊投料，升溫至30 ℃加入糖化酶，攪拌均勻后轉移到發酵池；

酒精發酵：入池后，于第二天加入酵母液（事先用糖液活化干酵母）同時進行糖化和酒精發酵，該過程的溫度維持在25～30 ℃，每天進行理化檢測，發酵6 d左右；

醋酸發酵：酒精發酵過程完成后，按比例補加輔料進行醋酸發酵，該階段每天翻坯一次，根據發酵醋醅酸度情況確定發酵結束時間，發酵30 d左右；

后熟：醋酸發酵結束后下鹽，每天翻坯一次，后熟3 d后取樣保存；

淋醋：淋醋，總酸含量在4g/100mL左右，取樣滅菌保存。

（2）熟料發酵工藝流程

工藝要點：

液化：將磨好的大米粉按比例添加到預先放好水的不銹鋼罐中，邊攪拌邊投料，攪拌均勻升溫至90 ℃加淀粉酶，保溫液化1 h，隨后升溫至100 ℃，保溫0.5 h滅酶活，再降溫至60 ℃，加入糖化酶；

糖化、酒精發酵：品溫降到30 ℃時，加入大曲和酵母液（事先用糖液活化干酵母）同時進行糖化和酒精發酵，該過程的溫度維持在25～30 ℃，每天進行理化檢測，發酵6 d左右；

醋酸發酵：酒精發酵結束后，將醪液轉移到發酵池，按比例補加輔料進行醋酸發酵，該階段每天翻坯一次，根據發酵酸度情況確定發酵結束時間，發酵30 d左右；

后熟：醋酸發酵結束后下鹽，每天翻坯一次，后熟3 d后取樣保存；

淋醋：淋醋，總酸含量在4g/100mL左右，取樣滅菌保存。

1.3.3 理化指標分析

總酸、不揮發酸含量的檢測參考GB/T 18187—2000《釀造食醋》，其中總酸檢測采用GB/T 5009.41—2003《食醋衛生標準的分析方法》中氫氧化鈉滴定法；還原糖含量采用GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》中直接滴定法；酒精含量采用GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中酒精計法。

1.3.4 風味物質與滋味物質分析

采用風味組學技術手段分別從風味與滋味兩個層面對生料與熟料制醋工藝中不同發酵節點樣品、發酵完成后的原池醋汁和淋醋后樣品進行檢測分析。采用電子鼻檢測手段獲得食醋樣品中揮發性成分的整體信息，電子舌則可以獲得樣品的不同滋味信息。

（1）風味物質的分析

電子鼻檢測設備由10個傳感器組成，10個傳感器對不同的揮發性化合物組成靈敏度有所差異，電子鼻的傳感器性能描述見表2。測試過程：準確量取200 μL米醋樣品，稀釋10倍后置于頂空進樣瓶內，封口后待測。分析條件：進樣流速300 mL/min，檢測時間90 s，傳感器自清洗時間100 s。為保證電子鼻測試結果的準確性，電子鼻系統在檢測之前要進行預熱和校準。每個樣品做5組平行，以數據的平均值進行統計分析。

表2 電子鼻不同傳感器對應香氣種類Table 2 Aroma types of electronic nose corresponding to different sensors

（2）滋味物質的分析

電子舌檢測設備由8個傳感器組成，8個傳感器對不同的滋味評價，各傳感器性能描述見表3。測試過程：準確量取6 mL米醋樣品，稀釋10倍后置于樣品杯中，采用電子舌進行分析。待儀器通過傳感器自檢后進行分析，每個樣品做4次循環，去掉第一次循環取后3次測量結果，傳感器響應穩定，重復性較好，即數據有效。為保證電子舌測試結果的準確性，電子舌系統在檢測之前均要進行校準。每個樣品5組平行，以數據的平均值進行統計分析。

表3 電子舌不同傳感器對應滋味種類Table 3 Flavor type of electronic tongue corresponding to different sensors

1.3.5 數據分析

采用SPSS 16.0對理化數據進行Oneway ANOVA方差分析，采用主成分分析（PCA）對風味物質進行分析。

2 結果與分析

2.1 生料、熟料發酵工藝過程和理化分析

2.1.1 糖化和酒精發酵

在糖化和酒精發酵階段，生料和熟料發酵醪液的酒精度、總酸（以乙酸計）和還原糖（以葡萄糖計）含量變化以及酒精發酵結束時酒精度、總酸和還原糖含量見圖1、圖2。從發酵第2天開始取樣檢測，3個生料發酵池樣品（110#、111#、112#）和2個熟料發酵池（2#、4#）樣品，并對其生料和熟料發酵工藝在酒精發酵期間的理化指標進行顯著性差異分析。

由圖1可知，生料或熟料在酒精發酵過程中，酵母菌迅速利用并發酵還原糖產生乙醇，同時少量糖被原料和空氣中附著的微生物代謝產酸，而隨著底物的減少，還原糖含量減少速度放緩。熟料發酵工藝的酒精含量在前期增加較快，而生料發酵工藝的總酸含量較高，分析其原因可能是熟料發酵工藝中原料由于經過高溫液化和淀粉酶解作用，再經糖化酶解后，生成還原糖的速度較快，從而酵母菌代謝還原糖產生乙醇的含量較生料發酵工藝的乙醇含量增加顯著（P＜0.05）；熟料發酵工藝中原料經高溫液化的同時也殺死了原料中絕大多數微生物，而生料發酵時由于糖化在較低溫度下進行，來自原料和大曲所攜帶的微生物的大量加入，其中的乳酸菌和醋酸菌會產生較熟料發酵時更多的乳酸和醋酸，因此總酸含量要高于熟料發酵（P＜0.01）。

圖1 糖化和酒精發酵過程中醪液的酒精度（A）、總酸（B）和還原糖（C）含量變化Fig.1 Changes in the alcohol content(A),total acid(B)and reducing sugar(C)in mash during saccharification and alcoholic fermentation

圖2 酒精發酵結束時醪液的酒精度、總酸和還原糖含量Fig.2 The contents of alcohol content,total acid and reducing sugar of the mash at the end of alcoholic fermentation

酒精發酵結束時，生料與熟料發酵醪液的酒精含量、總酸和還原糖含量的檢測結果與顯著性分析如圖2。由圖2可知，生料發酵工藝的總酸和還原糖含量均顯著高于熟料發酵工藝（P＜0.01），生料的總酸和還原糖含量分別為（1.29±0.06）g/100 mL、（0.37±0.06）g/100 mL，熟料的總酸和還原糖含量分別為（0.57±0.07）g/100 mL、（0.08±0.04）g/100 mL。

2.1.2 醋酸發酵

圖3 醋酸發酵過程中酒精度（A）、總酸（B）、還原糖（C）和不揮發酸（D）含量變化Fig.3 Changes in the alcohol content(A),total acid(B),reducing sugar(C)and non-volatile acid(D)in mash during acetic acid fermentation

糖化和酒精發酵結束時，兩種工藝產生的酒精量無顯著差異，但用生料發酵所產生的總酸和還原糖含量均較高，且從三個生料發酵池的所取樣品之不揮發酸含量（以乳酸計）分別為1.03 g/100 mL、1.49 g/100 mL、1.47 g/100 mL。完成酒精發酵后，發酵醅中加入稻殼和麩皮，開始醋酸發酵，從發酵第9天開始，每兩天取醋樣進行理化檢測，結果如圖3。醋酸發酵中，醪液中所含酒精在空氣和輔料中醋酸菌作用下，不斷將酒精轉化為醋酸，由圖3D可知，發酵前期還伴隨著乳酸菌等微生物作用產生乳酸等不揮發性有機酸。在發酵第9天時，兩工藝所產生的總酸量無差異，但熟料發酵醅的酒精含量相對較低（P＜0.01），從指標分析看由于熟料發酵過程的前期產酸速度較快，造成酒精轉化快；同時熟料發酵前期品溫升高較快，如圖4顯示，在發酵第2天品溫就達到40 ℃且在第9天前熟料溫度一直高于生料品溫，造成酒精揮發多且高溫抑制了酵母菌代謝產生酒精的速率。隨著發酵的進行，淀粉繼續被分解為還原糖，酒精不斷轉化為酸，直至酒精含量降為零，補加食鹽，抑制微生物代謝，進入風味后熟階段。

圖4 醋酸發酵過程中室溫和醋醅品溫變化Fig.4 Changes of room temperature and fermented grains temperature during acetic acid fermentation

醋酸發酵結束時醋樣的總酸、還原糖和不揮發酸含量結果以及顯著性分析結果如圖5。結果表明，發酵結束時生、熟料醋汁的總酸和還原糖含量并無顯著區別（P＞0.05），而不揮發酸含量差異顯著（P＜0.05），生料與熟料發酵醋汁的不揮發酸含量分別為（1.48±0.05）g/100 mL、（1.31±0.01）g/100 mL。

下鹽前與后熟醋樣的理化檢測值見表4。結果表明，下鹽壓醅后熟3 d時取原池醋汁，與下鹽前醋汁相比，生、熟料醋樣的總酸和不揮發酸含量均有所增加，還原糖含量減少。生料與熟料發酵醋樣的總酸和還原糖不具有顯著性差異（P＞0.05），不揮發酸含量在經后熟3 d后便不再具有顯著性差異（P＞0.05），兩者分別為（1.75±0.12）g/100 mL、（1.57±0.01）g/100 mL。在后熟階段還原糖參與美拉德反應，利于食醋色澤的形成，同時該過程還有利于乳酸等不揮發酸的形成，增強食醋風味。

圖5 醋酸發酵結束時醋樣的總酸、還原糖和不揮發酸含量Fig.5 The contents of total acid,reducing sugar and non-volatile acid of the mash at the end of acetic acid fermentation

表4 下鹽前與后熟醋樣的理化檢測值Table 4 Physical and chemical test values of vinegar samples before and after salting

2.2 風味物質和滋味物質的分析

發酵結束按照總酸要求淋醋，對淋醋醋樣別經過室溫儲存和曬制1個月和2個月進行陳釀。最終選取發酵中樣品、原池醋汁（后熟醋樣）、淋醋樣品和陳釀樣品進行風味和滋味方面的數據分析。

2.2.1 發酵過程中風味物質的檢測結果

（1）生料制醋工藝過程中樣品風味物質檢測

采用電子鼻技術對生料制醋工藝過程中的不同發酵時間節點、不同批次樣品進行檢測，檢測結果與風味的PCA分析見圖6。由圖6可知，第一主成分的方差貢獻率為88.85%，第二主成分的方差貢獻率為10.97%，其和為99.82%（＞85%），說明該方法有效。發酵過程中的樣品分析結果顯示，生料發酵中110#第一周與第二周樣品的風味接近，與第三周及后期樣品的風味差異較大，主要表現在2號（氮氧化合物）、7號（硫化物）、8號（醇、醛、酮類）、6號（甲基類）和9號（有機硫化物）幾個方面。

圖6 生料發酵食醋樣品在不同發酵時間呈香物質的雷達圖（A）及主成分分析圖（B）Fig.6 Radar graph (A) and PCA analysis (B) of aroma substances of vinegar samples with raw material fermentation at different fermentation times

（2）熟料制醋工藝過程中樣品風味物質檢測

圖7 熟料發酵食醋樣品在不同發酵時間呈香物質的雷達圖（A）及主成分分析圖（B）Fig.7 Radar graph (A) and PCA analysis (B) of aroma substances of vinegar samples with clinker fermentation at different fermentation times

在分析生料制醋樣品的基礎上，分別對熟料制醋工藝過程中的不同發酵時間節點的樣品進行檢測，電子鼻結果與風味的PCA分析結果見圖7。由圖7可知，第一主成分的貢獻率為81.47%，第二主成分的貢獻率為18.27%，其和為99.74%。發酵過程中樣品檢測結果顯示，第二周樣品至發酵后期及原池醋汁樣品的風味接近，而與發酵早期第一周樣品和淋醋樣品的風味差異較大，主要表現在2號（氮氧化合物）、7號（硫化物）和8號（醇、醛、酮類）幾個方面。

2.2.2 不同儲存條件對食醋產品風味的影響

食醋風味的差異一方面來源于原料與工藝，另一方面可能來自陳釀過程。因此，在分析生料與熟料制醋工藝的影響基礎上，以淋醋后的樣品為研究對象，進一步開展室內儲存與曬制過程對食醋樣品風味影響的探究。采用電子鼻檢測風味分析結果見圖8。由圖8可知，第一主成分的貢獻率為97.78%，第二主成分的貢獻率為2.21%，其和為99.99%，而且第一主成分貢獻率明顯大于第二主成分貢獻率，表明一定儲存期內對食醋風味的影響主要是由第一主成分決定的。

圖8 儲存與曬制過程中生料和熟料發酵醋樣呈香物質的雷達圖（A）與主成分分析圖（B）Fig.8 Radar graph (A) and PCA analysis (B) of aroma substances of vinegar samples with raw material fermentation and clinker fermentation during storage and sun-curing

結果表明，室內儲存過程對生料淋醋樣品和熟料淋醋樣品風味的影響較小，儲存一個月和兩個月樣品的風味差異較小。相比之下，曬制過程對生料淋醋樣品、熟料淋醋樣品的風味影響更為顯著。經曬制后，生料淋醋樣品與熟料樣品的風味仍然存在差異，但是與曬制前的樣品相比，風味的差異逐漸縮小。

2.2.3 發酵過程和不同儲存條件對食醋滋味物質的影響

（1）生料制醋工藝對發酵食醋的滋味影響

在風味分析的基礎上，進一步采用電子舌對生料制醋工藝過程中的不同發酵時間節點、儲存與曬制過程中生料淋醋樣品滋味進行對比，結果見圖9、圖10。由圖9和圖10可知，隨著發酵時間的不斷延長與發酵過程的持續進行，樣品的酸味、鮮味及咸味呈現逐漸增強的趨勢。曬制過程顯著影響食醋的滋味，主要表現在苦味、澀味、鮮味和咸味幾個方面。

圖9 生料發酵食醋樣品在不同發酵時間滋味的雷達圖Fig.9 Radar graph of flavor of vinegar samples with raw material fermentation at different fermentation times

圖10 儲存與曬制過程中生料發酵醋樣滋味的雷達圖Fig.10 Radar graph of flavor of vinegar samples with raw material fermentation during storage and sun-curing

（2）熟料制醋工藝對發酵食醋的滋味影響

熟料制醋工藝過程中的不同發酵時間節點、淋醋樣品的電子舌檢測結果見圖11。室內儲存和曬制過程對樣品滋味物質的影響，結果見圖12。由圖11和圖12可知，隨著發酵時間的不斷延長與發酵過程的持續進行，樣品的酸味、苦味、鮮味及咸味呈現逐漸增強的趨勢。對曬制前后熟料淋醋樣品的滋味分析表明，酸味回味、苦味、咸味的差異較為明顯。

圖11 熟料發酵食醋樣品在不同發酵時間滋味的雷達圖Fig.11 Radar graph of flavor of vinegar samples with clinker fermentation at different fermentation times

圖12 儲存與曬制過程中熟料發酵醋樣滋味的雷達圖Fig.12 Radar graph of flavor of vinegar samples with clinker fermentation at different fermentation times

3 結論

生料與熟料制醋工藝發酵食醋在糖化、酒精發酵階段，醋酸發酵以及后期儲存過程中產品指標和風味形成方面存在差異。

糖化、酒精發酵階段，熟料發酵工藝的產酒速度較快，但發酵結束時生料發酵工藝的醪液總酸和還原糖含量均顯著高于熟料發酵工藝；發酵結束時，生料的總酸和還原糖含量分別為（1.29±0.06）g/100 mL、（0.37±0.06）g/100 mL，熟料的總酸和還原糖含量分別為（0.57±0.07）g/100 mL、（0.08±0.04）g/100 mL。

醋酸發酵后期，生料發酵工藝的醋樣不揮發酸含量顯著較高，生料與熟料發酵醋汁的不揮發酸含量分別為（1.48±0.05）g/100 mL、（1.31±0.01）g/100 mL；而經后熟作用，生料與熟料發酵醋樣的不揮發酸含量差異縮小，兩者分別為（1.75±0.12）g/100 mL、（1.57±0.01）g/100 mL。

生料發酵與熟料發酵食醋的風味物質差異，主要表現在氮氧化合物、硫化物、醇、醛、酮類、甲基類和有機硫化物幾個方面。曬制過程對生料和熟料食醋的風味影響顯著，且經過曬制2個月后，生料與熟料食醋的風味仍存在差異，但與曬制前的樣品相比，風味的差異逐漸縮小。發酵過程和曬制前后不同工藝發酵的食醋在苦味、澀味、酸味回味、鮮味和咸味方面均差異明顯。