常壓室溫等離子體誘變選育高產微生物絮凝劑黑曲霉菌株

楊佩斯，李 祝，唐婧紅，趙妗頤，張 素

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

微生物絮凝劑（microbial flocculant）是由微生物細胞成分提取或新陳代謝產生，能使廢水中污染顆粒物、膠體懸浮物、有害微生物等微粒發生凝集、沉淀的一類特殊活性有機物[1]，其主要成分為脂類[2]、蛋白質[3]、多糖[4]、核酸[5]等。具有安全無污染、材料環保、容易降解等優點[6]，在綠色環保、農業安全、醫藥衛生等領域具有無限良好的應用前景。法國生物學家微生物學之父PASTEUR L最早在酵母菌中發現微生物的絮凝特性[7]；NAKAMURA J等[8-9]陸續從自然界分離到具有絮凝特性的醬油曲霉（Aspergillus sojae）AJ 7002和紅平紅球菌（Rhohococcus erthropolis），分離提取活性物并制成絮凝劑，用于處理污泥、畜產廢水、廢水脫色及磚場生產廢水，取得了良好的治理效果；LEE S H等[10]采用多步沉淀法從Archuadendronsp.TS-49中分離得到絮凝劑，檢測其成分為己糖胺和蛋白質；HE J等[11]培養鹽單胞菌（Halomonassp.）制備絮凝劑HBF-3并研究其絮凝橋聯作用；YIN Y J等[12]從克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）中提取到絮凝劑ZZ-3，并證實其多糖成分和絮凝機理。目前，科研人員已從不同環境中分別分離出多種具有絮凝特性的微生物，涵蓋微生物種屬數十個[13-16]。目前主要問題是高產菌株難獲得、不穩定、微生物絮凝劑的產量太低，導致生產應用成本過高，限制了的商業的實際應用。選育微生物高產絮凝劑菌株是微生物絮凝劑可以得以早日應用和產量增加的方法，已成為環境微生物領域研究的新熱點。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術是近年來開發應用的一種新生物育種技術，利用激發態物質在強電場中產生的等離子體使生物細胞胞內遺傳物質突變，從而讓生物體產生新性狀和穩定遺傳的特性[17]。與其他育種技術相比，該技術具有輻射均勻、工作溫度低（＜40 ℃）、操作安全簡便等特點，現已應用于農作物玉米[18]、大豆[19]、小麥[20]等生長抗逆性研究。此外，大量研究顯示，采用ARTP技術對酵母[21-22]、細菌[23-24]、真菌[25-26]等進行誘變選育，突變菌株發酵后酶和激素等代謝物的產量均有所提高。但是，以ARTP技術選育高絮凝菌株的研究鮮見報道。

本研究采用ARTP誘變技術對黑曲霉（Aspergillus niger）xj進行誘變，旨在研究ARTP對微生物產絮凝劑的影響，以期篩選出絮凝活性高、遺傳穩定的菌株，為ARTP在微生物絮凝菌株選育方面提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：貴州大學生命科學院微生物所分離、鑒定，保藏于中國典型培養物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC）（保藏號：CCTCC NO.M 206021）。

1.1.2 試劑

高嶺土、吐溫80、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[27]：馬鈴薯200 g切碎成塊狀煮20 min，紗布過濾加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水至1 000 mL，調節pH值7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養基：PDA培養基中不添加瓊脂。

1.2 儀器與設備

ⅡS型ARTP誘變育種儀：江蘇無錫源清天木生物科技有限公司；DP-350漩渦振蕩儀：北京亞歐德鵬科技有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；PHS-3C精密酸堿計：上海大普儀器有限公司；BIOMATE 3S紫外可見光分光光度計：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉xj孢子懸液的制備

取斜面保存的黑曲霉xj劃線接種于PDA培養基平板，28 ℃恒溫培養5～7 d，待平板表面長滿黑曲霉菌體，用接種環輕輕刮取表面的孢子，加入1 g/L吐溫80沖洗2～3次。吸取孢子懸液轉移至裝有少量玻璃珠的錐形瓶中，室溫振蕩10 min使孢子充分分散，脫脂棉過濾，得到黑曲霉菌絲。繼續采用吐溫80稀釋孢子懸浮液，通過血球計數板[28]計算黑曲霉孢子濃度，調整孢子懸浮液終濃度為1×107CFU/mL。

1.3.2 常壓室溫等離子體誘變方法

取10 μL黑曲霉xj孢子懸浮液，均勻涂布于無菌金屬載片表面，風干，將金屬載片置于ARTP誘變育種儀內分別誘變30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s、270 s、300 s，其他誘變條件為誘變功率120 W、氦氣（He）通氣量10 L/min、輻射距離2 mm。誘變結束后將金屬載片轉移至裝有無菌水的EP管中，在漩渦振蕩儀上充分振蕩以形成新的黑曲霉孢子懸液，用無菌涂布棒將不同處理時間下的黑曲霉孢子懸浮液稀釋涂布于PDA培養基平板，28 ℃恒溫培養24 h。以未處理樣品（0 s）為對照，通過平板菌落計數法[29]計算誘變致死率，繪制菌株致死率曲線，其計算公式如下：

同時，考察誘變菌株所產絮凝劑對高嶺土懸液的絮凝率，并計算正突變率，其計算公式如下：

最后，根據致死率及正突變率確定最佳誘變時間。

1.3.3 絮凝率的測定

絮凝劑的制備：取5mL孢子懸浮液（1×107CFU/mL）接種于PDB培養基中，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養72 h，過濾，取發酵液，10 000 r/min冷凍離心10 min，上清液即為絮凝劑。

絮凝率的測定：取4 mL絮凝劑滴加入95 mL 0.4%的高嶺土懸液中，以1 mL 1%CaCl2作為助凝劑，室溫攪拌（400 r/min攪拌1 min，200 r/min攪拌5 min，80 r/min攪拌1 min），靜置10 min，以滴加去離子水為對照，吸取液面1～2 cm處的液體，采用紫外分光光度計在波長550 nm處測定吸光度值，計算絮凝劑對高嶺土懸液的絮凝率，其計算公式如下：

式中：A為對照的OD550nm值；B為樣品的OD550nm值。

1.3.4 菌株絮凝活性的篩選

初篩：選取誘變菌株，制備絮凝劑，并計算其對高嶺土懸液的絮凝率。

復篩：選取初篩誘變菌株中絮凝率≥80%的菌株，培養制備絮凝劑，并計算其對高嶺土懸液的絮凝率，選取絮凝率≥80%菌株作為研究對象[30]。

1.3.5 菌株生物量的測定

選取復篩誘變菌株中絮凝率≥80%的菌株，對其進行同期發酵培養，通過測定菌體生長量來觀測菌株生長狀況[30]。

1.3.6 遺傳穩定性分析

微生物的突變或退化極不穩定，為檢驗突變株在生產過程中的遺傳穩定性，選取高絮凝突變株與原始黑曲霉xj接種于PDB培養基，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養72 h，測定絮凝率，傳代培養7次后，考察發酵液絮凝活性的穩定性。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變致死率和突變率曲線

大量研究表明，在常壓室溫等離子體誘變儀誘變育種過程中，氣流量、照射距離、放電強度和照射時間是影響菌株誘變效率的顯著因素[31]。為保證等離子體在40 ℃以下進行，設定氦氣（He）通氣量10 L/min、輻射距離2 mm、誘變功率100 W，在此條件下，等離子體誘變的輻射強度由工作時長決定[12，17]。不同誘變時間（0～300 s）條件下，黑曲霉xj的正突變率和致死率見圖1。

圖1 常壓室溫等離子體誘變時間對黑曲霉孢子致死率、正突變率的影響Fig.1 Effect of atmospheric and room temperature plasma mutation time on lethality and positive mutation rate of Aspergillus niger spore

由圖1可知，黑曲霉（Aspergillus niger）xj致死率與等離子體照射時間有明顯的劑量累積效應，菌體的致死率隨著照射時間的延長而升高。當照射時間＞90 s之后，黑曲霉xj致死率＞90%；當照射時間為150～300 s，致死率接近100%。誘變時間過長容易致死，而誘變時間過短不易發生突變。黑曲霉xj正突變率對著誘變時間的延長呈先升高后降低的趨勢，當照射時間為90 s時，正突變率最高為27.8%。綜合考慮正突變率與致死率，選擇90 s為黑曲霉xj的最佳誘變時間。等離子體具有不定向性和隨機性，據文獻報道[32]，菌株正突變率高，致死率＞90%時，菌落易分散、生長較好、挑選單菌落方便。因此，主要選取正突變率高、致死率＞90%的平板對絮凝劑高產菌株進行篩選。

2.2 高產絮凝劑菌株的篩選

通過初篩共獲得416株對高嶺土懸液具有絮凝活性的菌株，部分菌株的絮凝率見表1。

由表1可知，突變菌株的絮凝率均高于出發菌株，其中30株突變菌株的絮凝率較高，均＞80%，較初始菌株提高了13.03%～25.99%。選取這30株突變菌株進行復篩，進一步測定絮凝率絮凝率＞80%的菌株，結果見表2。

表1 產絮凝劑突變菌株的初篩部分結果Table 1 Partial results of preliminary screening of flocculant-producing mutant strains

表2 產絮凝劑突變菌株的復篩結果Table 2 Results of secondary screening of flocculant-producing mutant strains

由表2可知，復篩后只有10株菌株絮凝率＞80%，表明初篩、復篩兩次都有較好活性。其中突變菌株A90-37的絮凝率最高，為（94.96±0.15）%，較原始菌株高27.03%；其次為突變菌株A90-34，絮凝率為（94.12±0.16）%，較原始菌株高26.19%。為進一步研究復篩后菌株生長狀況與活性，對10株菌同步發酵，測定生物量，結果見圖2。

由圖2可知，所有突變菌株的生長趨勢與原始菌株一致，且較原始菌株生長較快，其中菌株A90-34與A90-37的生長最為迅速，與其活性較高呈一定相關性。

圖2 原始菌和突變株的生長曲線Fig.2 Growth curves of original strain and mutant strain

2.3 高產絮凝劑菌株的遺傳穩定性分析

微生物菌株的遺傳穩定性在實際的發酵生產應用中至關重要，突變菌株在傳代生產絮凝劑過程中可能會發生回復突變，出現表型延遲或退化現象，從而導致高產誘變的菌株傳代后出現生產性能衰退[33]，因此需對菌株傳代過程進行考察，確定其遺傳過程中是否具有穩定性。為驗證突變株遺傳穩定性，對突變菌株進行7代連續發酵培養，并檢測每一代發酵液的絮凝活性，結果見表3。

由表3可知，突變菌株A90-34和A90-37的P值＞0.05，即菌株連續傳代7次，絮凝率無顯著差異（P＞0.05），具有較良好的遺傳穩定性，且絮凝率較高，為92%～95%。

表3 突變菌株的遺傳穩定性Table 3 Genetic stability of mutant strains

3 結論

本研究采用常壓室溫等離子體（ARTP）技術誘變黑曲霉（Aspergillus niger）xj，最佳誘變照射時間為90 s，通過搖瓶發酵培養篩選出2株高產絮凝劑的突變菌株A90-34和A90-37，其對高嶺土懸液的絮凝率分別為94.12%和94.96%，與原始菌株相比，分別提高26.19%、27.03%，連續傳代7次仍具有良好的遺傳穩定性，絮凝率維持在92%～95%。