保加利亞乳桿菌發酵黃瓜汁產物分析及生物活性評價

陳 琦，趙 星，陳小蝶，徐雨晗，廖勝佳，何 毅

（武漢輕工大學 食品科學與工程學院 湖北省農產品加工與轉化重點實驗室 大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430023）

黃瓜原名胡瓜[1]，原產地為印度，是葫蘆科中廣泛栽培的植物[2]。黃瓜含有豐富的糖、蛋白質和維生素等人體所需的營養物質[3]。根據何念武等[4]研究發現，黃瓜具有抗衰老、美白嫩膚以及防治酒精中毒[5]等功效。此外，BALKEMABOOMSTRA A G等[6]研究發現，黃瓜所特有的葫蘆素C具有預防癌癥和糖尿病的功能。

牛奶是人類重要的營養來源[7]，內含豐富的乳糖[8]和乳蛋白[9]。以牛奶和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）為原料通過乳酸發酵而得到的產品較多[10]，如紅棗酸奶[11]，藍莓枸杞酸奶等[12]。這些產品深受廣大消費者的喜愛。

近年來，隨著經濟的發展，人們的生活水平逐步提高，國內的科技工作者已經就一些蔬菜原料進行乳酸菌發酵研究，得到了初步的進展。在國外，希臘、德國等一些國家進行了發酵蔬菜汁的研究，單一成分的發酵乳制品已不能滿足人們對食品的營養需求。SILVA V L M等[13-14]對藍莓發酵乳、蘋果葡萄干發酵乳進行了研究。本研究以黃瓜和牛奶的混合物為研究對象，采取液態發酵方法研究發酵液的營養物質及生物活性，并采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對發酵液的香氣成分進行分析。由于黃瓜中富含葉酸，牛奶含有能與葉酸結合的蛋白質。將黃瓜和牛奶相結合能夠提高葉酸的生物利用度和穩定性[15]。同時在原料中加入黃瓜能使凝固型酸奶散發一種黃瓜特有的清香味，增加酸奶的感官品質，豐富花色酸奶的種類，拓寬復合乳酸飲品市場，滿足人類豐富的飲食需求，也能為黃瓜的深加工提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃瓜、鮮牛奶：市售；高純度保加利亞乳桿菌菌粉：法國丹尼斯克公司；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）試劑盒：碧云天生物技術公司；無水碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、乙二胺四乙酸二鈉、焦性沒食子酸等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SB-5200超聲波清洗機：北京市永光明醫療儀器有限公司；STARTER3100 pH計：普蘭德（上海）貿易有限公司；AL204型電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司；CR22GIII高速冷凍離心機：日本Hitachi公司；Lambda25紫外分光光度計：德國PERKINELMER公司；UV-4802型紫外全掃描分光光度計：武漢利天科技儀器有限公司；SpectraMax M2e酶標儀：美國Molecular Devices公司；7890A/5957C氣相色譜質譜儀：美國Aglient科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃瓜汁乳酸菌發酵工藝流程及操作要點

操作要點：

（1）選用成熟且組織脆嫩，肉質新鮮的黃瓜，洗凈表皮污泥雜質和殘留農藥。將洗凈的黃瓜，放入75～85 ℃熱水中熱燙3～5 min，將熱燙后的黃瓜瀝干，切除兩端瓜蒂，切成1～2 cm3的碎塊用打漿機打漿，將打漿完畢的黃瓜汁倒入200目濾布中進行初濾，經初濾后的黃瓜汁再由抽濾器抽濾，得到無殘渣的黃瓜汁。

（2）混料：將2 100 mL黃瓜汁、900 mL純牛奶、180 g白糖，依次加入潔凈的發酵罐中，用干凈的玻璃棒攪拌均勻。

（3）滅菌：將發酵罐蓋好放在高壓滅菌鍋內，121 ℃滅菌20 min。取出后置于室溫冷卻至30～40 ℃左右，用于接種。

（4）接種：醪液冷卻后，在無菌臺中取一小匙該種菌粉加入發酵罐中，接種量為0.01%，隨后蓋緊蓋子，并在發酵罐蓋子上進行水封，避免在培養過程中遭到雜菌感染。菌種添加量為0.01%，發酵溫度37 ℃，發酵時間3 d。發酵完畢后調配、灌裝，85 ℃滅菌20 min后即得成品。

1.3.2 pH值的測定

采用STARTER3100 pH計測定發酵液的pH值。

1.3.3 總酸的測定采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定發酵液中總酸含量[16]。

1.3.4 總酚的測定

根據文獻[17]，采用福林酚法測定發酵液中總酚含量。

標準曲線繪制：精確稱取干燥至質量恒定的沒食子酸10.0 mg，溶解后加水定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。準確吸取沒食子酸標準溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL刻度試管中，加5.0 mL蒸餾水，再加0.5 mL福林酚試劑，搖勻1 min后再加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，于室溫反應2 h。以0號管為空白，在波長760 nm處測定對照品溶液的吸光度值。以沒食子酸質量（μg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線。

準確稱取樣品0.4 mL，配成1.0 mg/mL的水溶液，精密量取1.0 mL于10 mL刻度試管中，按標準曲線制備操作步驟于波長760 nm處進行吸光度值的測定（樣液如有沉淀，應過濾后測定）。查標準曲線或用線性方程計算，最后算出總酚含量，每個樣品重復測定3次。

1.3.5 總糖的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法[18]。精確稱取干燥至恒質量的葡萄糖10.0 mg，溶解后加水定容到100 mL，配制成0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液，準確吸取葡萄糖標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL刻度試管中，分別加入蒸餾水1.0 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0，再分別加入0.5 mL苯酚溶液0.5 mL，再加入2.5 mL的濃硫酸，冷卻后，以0號管為空白，在波長490 nm處測定對照品溶液的吸光度值。以葡萄糖溶液質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

準確吸取樣品0.1 mL，按標準曲線制備操作步驟于波長490 nm處進行吸光度值的測定。按照標準曲線線性方程計算，最后算出總糖含量，每個樣品重復測定3次。

1.3.6 乳酸的測定

采用GB/T23877—2009《飼料酸化劑中檸檬酸、富馬酸和乳酸的測定高效液相色譜法》[19]中和滴定法進行測定。

1.3.7 抗氧化性實驗

（1）羥自由基清除率的測定

采用水楊酸法[20]測定羥自由基清除率。在10 mL刻度具塞試管中依次加入6 mol/L的FeSO4溶液2 mL、不同質量濃度（0.5 mg/mL、1 mg/mL、3 mg/mL）的樣品溶液2 mL和6 mol/L的H2O2溶液2mL，混合搖勻，靜置10 min，再加入2 mL的6 mol/L水楊酸溶液，混合搖勻，靜置30 min，于波長510 nm處測定其吸光度值，同時以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照?？瞻讓φ盏奈舛戎涤洖锳0；無水楊酸時樣品的吸光度值記為A1；加入樣品后的吸光度值記A2。羥自由基清除率按下式計算：

（2）DPPH自由基清除率的測定[21]

取一定量的DPPH粉末，用無水乙醇將其配成濃度為0.15 mol/LDPPH無水乙醇溶液，在黑暗中低溫保存。取2 mL DPPH無水乙醇溶液和0.2 mL樣品溶液加1.8 mL無水乙醇溶液，并將在517 nm處測量的吸光度值記錄為A1。用等量的無水乙醇代替樣品溶液作為樣品背景組，并將吸光度值記錄為A0。使用等量的無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液作為空白對照，并將吸光度值記錄為A2，同時以VC為陽性對照[22]。DPPH自由基清除率按下式計算：

（3）ABTS法測定抗氧化能力[23]

在波長735 nm處測定各個濃度的Trolox標準溶液吸光度值。得到并根據標準曲線（A=-0.778 9C+1.224 5（R2=0.999 3））計算出樣品的總抗氧化能力，樣品抗氧化能力以trolox-equivalent antioxidant capacity（TEAC）來表示，同時以VC為陽性對照。

1.3.8 氣相色譜-質譜法分析發酵液揮發性成分[24]

（1）揮發性物質的提?。喝? mL離心后的樣品于50 mL頂空瓶中，樣品于55 ℃的孵化溫度條件下孵化60 min，振蕩轉速為250 r/min，振蕩開10 s關1 s。結束后吸取1 000 μL的氣體進行解析。

（2）色譜條件：DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 m）色譜柱；氣化溫度250 ℃；初始柱溫40 ℃；升溫程序：40 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；高純載氣（He）；流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；進樣口不分流。

（3）質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度240 ℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍35～500 m/z[25]。

1.3.9 數據處理

采用SPSS19.0軟件，對試驗結果進行統計分析，利用方差分析進行各試驗組間的顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 pH和總酸含量的變化

由圖1可知，隨著發酵的進行，發酵液的pH值整體呈下降趨勢，最終穩定在4.0左右。pH值的下降是由發酵液中有機酸濃度的增加引起的，主要原因是乳酸含量的增加[26]。pH值隨著有機酸濃度的增加而逐漸降低，因此pH值的下降和總酸含量的上升在時間上表現出一致性。發酵液的總酸含量總體呈上升趨勢，在第13天后維持在50.5 g/L左右。此結果說明黃瓜汁乳酸菌發酵在7 d內基本完成。

圖1 發酵時間對發酵液總酸含量和pH值的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total acid contents and pH value of fermentation broth

2.2 總糖含量的變化

發酵時間對發酵液總糖含量的影響見圖2。由圖2可知，總糖含量先降后升，從開始發酵至發酵第3天，總糖含量呈下降趨勢，在第3天含量為72.53 g/L，隨后上升。在第5天時總糖含量達到最高，含量為89.15 g/L，隨后逐漸下降。糖是發酵過程中微生物生長和代謝的主要碳源，在發酵初期，乳酸菌繁殖會消耗大量糖分，此時總糖含量呈下降趨勢；隨著發酵時間的延長，乳酸菌分泌大量的酶降解發酵液中碳水化合物并產生大量可溶性糖，糖的產生量大于乳酸菌對糖的消耗量，使總糖含量上升；在發酵后期，由于乳酸菌數量逐漸增多，對糖的消耗量大于可溶性糖的產生量，因此總糖含量呈下降趨勢[27]。

圖2 發酵時間對發酵液總糖含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on total sugar contents of fermentation broth

2.3 總酚含量的變化

發酵時間對發酵液總酚含量的影響見圖3。由圖3可知，發酵罐中的總酚含量在發酵初期呈下降趨勢，在第2天含量最低，為0.138 mg/mL，隨后逐漸上升，最終穩定在0.198 mg/mL。在發酵初期，體系中的溶氧量高，多酚類物質氧化較快，從而促使總酚含量下降。乳酸菌數迅速增加，由于酪蛋白水解、多肽及多酚物質的分解加速，酸奶中游離氨基酸、多酚的質量濃度也急劇上升。發酵液中形成固定了游離的水分，蛋白酶、多肽酶類及多酚的運輸和活性以及物質運輸受到了很大的限制，游離氨基酸和多酚質量濃度增加緩慢[28]。

圖3 發酵時間對發酵液總酚含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total phenolic contents of fermentation broth

2.4 乳酸含量的變化

發酵時間對發酵液乳酸含量的影響見圖4。由圖4可知，乳酸含量的變化整體呈上升趨勢，在第3天含量達最高為5.5 g/L，隨后緩慢下降最終穩定在5.0 g/L左右。在發酵液發酵過程中，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌利用乳糖進行生長繁殖，產生大量乳酸，隨著發酵時間的延長，發酵液總酸含量增加，菌體的生長逐漸受到抑制，乳酸含量也逐步平穩[29]。

圖4 發酵時間對發酵液乳酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on lactic acid contents of fermentation broth

2.5 抗氧化性的變化

2.5.1 清除羥基自由基

羥自由基是生物體中重要的活性氧自由基之一，具有較強的氧化性，對人體具有一定的危害[30]，由圖5可知，發酵液中的羥自由基清除率隨著發酵時間的增加逐漸升高。在發酵末期，羥自由基清除率最高可達87%，高于7 μg/mL VC對羥基自由基的清除率，這是因為發酵液中的總酚含量較高且黃瓜多糖具有較高的羥基自由基清除能力[31]。

圖5 黃瓜汁乳酸菌發酵產物（A）和VC（B）的羥自由基清除率變化Fig.5 Changes of hydroxyl free radical scavenging rate of lactic acid bacteria fermentation products of cucumber juice (A) and VC (B)

2.5.2 DPPH自由基清除能力

圖6 黃瓜汁乳酸菌發酵產物（A）和VC（B）的DPPH自由基清除率變化Fig.6 Changes of DPPH free radical scavenging rate of lactic acid bacteria fermentation products of cucumber juice(A)and VC(B)

DPPH是一種穩定的自由基，它的存在會對生物體造成一定的危害[32]。由圖6可知，DPPH自由基清除率隨著發酵時間的增加逐漸升高，發酵末期最高達85.12%，與7 μg/mL VC對DPPH自由基的清除率接近。

2.5.3 總抗氧化能力

根據相關研究結果表明，物質的抗氧化能力越強，更有利于減少機體的相關細胞損傷[33]。由圖7可知，總抗氧化能力在前3天大幅提升，在后期增長趨勢逐漸趨于平緩，總抗氧化能力最高與0.85 mmol/L的Trolox的抗氧化能力相同，高于0.70 mmol/L VC的總抗氧化能力。這種變化趨勢是因為發酵乳經過乳酸菌的發酵作用，產生了許多具有生物活性的物質，使發酵乳具有了一定的抗氧化性[28，34]。

圖7 黃瓜汁乳酸菌發酵產物（A）和VC（B）的總抗氧化能力變化Fig.7 Changes of total antioxidant activity of lactic acid bacteria fermentation products of cucumber juice (A) and VC (B)

2.6 GC-MS分析揮發性成分

經氣相色譜質譜聯用儀定性分析發酵液，共檢測出22個峰，主要揮發性成分組成及其相對含量（占揮發性成分總量的比例）見表1，發酵液中共鑒定出22 種揮發性風味物質，其中烴類、酯類、酮類、醛類、酸類、醇類以及胺類分別為6、6、1、3、2、2 種和2種。由表1計算得，該揮發性成分中烷類占比68.4%，酯類占比10.61%，酮類占比0.98%，醛類占比9.79%，酸類占比5.03%，醇類占比1.99%，胺類占比3.2%。但檢出物質并不全是香氣成分，比如膽甾-3,5-二烯。發酵液的主要香氣物質為壬醛、癸醛、癸酸乙酯、2-氨基-1-苯基-乙酮等。

圖8 發酵液中揮發性成分氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of aroma components in fermentation liquor

表1 發酵液中主要揮發性成分及相對含量Table 1 Volatile components and relative contents in fermentation broth

由圖8和表1可知，黃瓜發酵液的揮發性成分中烷類化合物和酯類化合物含量較高，酸類化合物和酮類化合物含量較低。一般認為酸奶中的主要香氣成分為酸類化合物、酮類化合物和醛類化合物等。出現該差異的原因可能是由于部分香氣成分存在于發酵液中未被檢測出，有待進一步檢測。

3 結論

以黃瓜和牛奶為原料，利用保加利亞乳桿菌對黃瓜牛奶混合物進行發酵，采用的發酵工藝條件為：黃瓜汁與純牛奶的體積比為7∶3，接種量0.01%，初始pH值6.1，發酵溫度37 ℃，發酵時長3 d。在該工藝下發酵所得的黃瓜汁乳酸菌發酵乳的總酸最終含量為50.5g/L，總酚含量為0.165 mg/mL，其羥自由基清除率最高可達87%，DPPH 自由基清除率可達85.12%，總抗氧化能力最高與0.85 mmol/L的Trolox的抗氧化能力相同，高于0.70 mmol/L VC的總抗氧化能力。黃瓜發酵液的揮發性成分中烷類占比68.4%，酯類占比10.61%，酮類占比0.98%，醛類占比9.79%，酸類占比5.03%，醇類占比1.99%，胺類占比3.2%。其中烷類化合物和酯類化合物含量較高，酸類化合物和酮類化合物含量較低。由于本實驗中采用的滅菌方法耗時較長，今后可結合食品非熱殺菌技術，采取合理的殺菌方式，提高生產效率，并能最大限度保留產品中的多酚、多糖等營養成分。