蘋果酒品質檢測中電子鼻和電子舌檢測參數的優化

曹有芳，徐俊南，劉 丹，樊明濤

（西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

蘋果酒含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質及多酚等活性物質，是世界上僅次于葡萄酒的第二大發酵果酒，具有軟化血管、降血脂、降血壓、調節新陳代謝、抗衰老和抗癌等作用，深受消費者喜愛[1-2]。就目前蘋果酒發酵技術的研究深度和發展程度而言，因蘋果原料和發酵工藝等不同，直接導致了蘋果酒品質的差異性。而目前單純利用感官評定方法評價蘋果酒的品質往往不夠客觀，因此尋找一種快速、靈敏的檢測方法尤為重要。電子鼻和電子舌由化學傳感器和模式識別系統構成，能根據樣品的響應信號得到樣品的綜合評價信息，可以對不同樣品的揮發性物質和滋味信息進行對比分析，還可以通過采集標樣信息建立數據庫，利用化學計量學方法對未知樣品進行定性和定量分析[3-4]。

目前，電子鼻和電子舌已經廣泛應用于白酒、葡萄酒、黃酒及啤酒的品牌區分[5-6]、風味分析[7-8]、香型分析[9]、產地辨別[10-11]、品種辨別[12-13]、酒齡辨別[14-16]、真偽鑒別[17]以及發酵過程中的動態監測[18]等方面，而通過電子鼻和電子舌與多變量數據分析區分不同蘋果酒的研究鮮有報道。電子鼻和電子舌傳感器的響應值與樣品種類、質量、狀態、溫度及環境等因素都有很大聯系。因此，在電子鼻和電子舌檢測樣品前，進行實驗參數的優化很有必要[4，19-22]。本試驗采用不同產地相同蘋果品種共3種蘋果進行蘋果酒的釀造，以蘋果酒為研究對象，考察樣品稀釋倍數、頂空進樣體積、頂空生成時間和載氣流速4個實驗參數對電子鼻傳感器響應信號的影響，同時考察樣品稀釋倍數對電子舌傳感器響應信號的影響，利用模式識別和統計學方法優化確立較佳實驗參數。在最佳參數條件下，用電子鼻和電子舌對蘋果酒進行區分和風味評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長富二號蘋果（分別采于陜西白水蘋果試驗站，山東煙臺，甘肅慶陽試驗站），共3種實驗樣品；安琪果酒專用酵母SY：安琪酵母股份有限公司；Macerozyme R-10果膠酶（酶活40 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司。氯化鈉（純度≥99.5%）：四川西隴科學有限公司；2-辛醇（純度≥98%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

2000JP榨汁機：南通金橙機械有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；PEN3型便攜式電子鼻：德國Airsense公司；電子鼻10個金屬氧化物傳感器的敏感物質類型見表1；Astree 電子舌系統：法國Alphamos公司；電子舌各個傳感器的檢測閾值見表2。

表1 PEN3電子鼻傳感器陣列及其對應的敏感物質類型Table 1 Electronic nose sensor PEN3 array and its corresponding sensitive material types

表2 電子舌各個傳感器的檢測閾值Table 2 Detection thresholds of each sensor of electronic tongue

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

操作要點：選擇成熟度好，無腐爛變質的蘋果，進行清洗、榨汁，將得到的蘋果清汁倒入經SO2熏蒸過的發酵罐，并加入60 mg/L SO2。按50 mg/L的量添加果膠酶室溫酶解12 h后，加入安琪果酒專用酵母SY于20 ℃條件下發酵7 d，所有蘋果酒的發酵工藝相同。取發酵結束的新鮮酒樣，離心冷凍置-20 ℃冰箱內待用。

1.3.2 電子鼻檢測

受樣品稀釋倍數、頂空進樣體積、頂空生成時間和載氣流速4個因素的影響，頂空氣體的濃度直接影響傳感器響應值。采用表3設計的因素水平，研究樣品稀釋倍數、頂空進樣體積、頂空生成時間和載氣流速對電子鼻各傳感器響應值的影響，每組9個平行。

電子鼻測試條件：電子鼻開機后先預熱0.5 h左右，將稀釋的蘋果酒樣品置于30 mL的頂空瓶中，封蓋富集進行測試。測試步驟：將補氣針和進樣針同時插入頂空瓶中，采樣60 s 后，同時拔出進樣針和補氣針，讓系統進行清洗（清洗時間為300 s）和標準化過程，其后可繼續測試樣品。

表3 單因素試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of single factor experiments

1.3.3 電子舌檢測

電子舌傳感器的響應值受樣品稀釋倍數的影響，本研究將樣品分別稀釋10、15、20、25、30倍，研究樣品稀釋倍數對電子舌傳感器響應值的影響，每組3個平行。

電子舌開機后依次進行Conditioning-Calibration-Diagnose 步驟，系統通過校正后，進行測試。將蘋果酒樣離心、過濾除去雜質，再經10倍稀釋后，取85 mL于電子舌專用燒杯中進行檢測。

1.3.4 數據分析方法

采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）及顯著性分析，顯著水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗方差分析

提取各傳感器15 s和50 s的響應值，對數據進行單因素方差分析，結果如表4和表5所示。

表4 傳感器15 s的數據單因素試驗方差分析Table 4 Variance analysis of sensors 15 s data by single factor experiments

表5 傳感器50 s的數據單因素試驗方差分析Table 5 Variance analysis of sensors 50 s data by single factor experiments

2.2 電子鼻最佳檢測條件的確定

2.2.1 稀釋倍數對電子鼻傳感器響應值的影響

取頂空進樣體積5 mL、頂空生成時間5 min和載氣流速300 mL/min，研究不同樣品稀釋倍數（20、30、40、50、60）對電子鼻傳感器響應信號的影響。對各傳感器達到響應信號峰值時刻（15 s）的數據進行分析，由表4可看出，樣品稀釋倍數對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）；由表5中電子鼻傳感器50 s響應值的方差分析結果可看出，當頂空氣體達到平衡穩定后，樣品稀釋倍數對10個傳感器也均有顯著影響（P＜0.05）。

由圖1可看出，PCA分析結果中第一主成分占比99.23%，第二主成分占比0.60%，前兩個主成分總貢獻率占比99.83%，能充分代表原始數據信息。樣品稀釋倍數隨第一主成分減小方向逐漸減小，隨第二主成分增加的方向先減小后增加。不同稀釋倍數的樣品完全可以區分開，其中稀釋30倍的樣品聚集效果較好，類內離差較小，因此選取30倍為樣品最佳稀釋倍數。

圖1 不同樣品稀釋倍數條件下電子鼻數據主成分分析圖Fig.1 PCA results of electronic-nose responding data with different sample diluted multiples

2.2.2 頂空進樣體積對電子鼻傳感器響應值的影響

取頂空生成時間5 min、載氣流速300 mL/min，將樣品稀釋30倍，研究頂空進樣體積（2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL）對電子鼻傳感器響應信號的影響。對各傳感器達到響應信號峰值時刻15 s的數據進行分析，由表4可看出，除S4和S7傳感器外，頂空進樣體積對其他8個傳感器的響應值均有顯著影響（P＜0.05）；由表5中電子鼻傳感器50 s時的響應值方差分析結果可看出，當頂空氣體達到平衡穩定后，頂空進樣體積對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）。

圖2 不同頂空進樣體積條件下電子鼻數據主成分分析圖Fig.2 PCA results of electronic nose responding data with different headspace sampling volume

由圖2可看出，PCA分析結果中第一主成分占比91.82%，第二主成分占比5.56%，前兩個主成分總貢獻率占比97.38%，能充分的代表原始數據信息。頂空進樣體積隨第一主成分增加的方向先增加后減小，隨第二主成分增加的方向先減小后增加。此外，不同頂空進樣體積的樣品完全可以區分開，其中5.0 mL的樣品數據點聚集性較好，類內離差較小，因此選取5.0 mL為最佳頂空進樣體積。

2.2.3 頂空生成時間對電子鼻傳感器響應值的影響

將樣品稀釋30倍，取進樣體積5.0 mL、載氣流速300 mL/min，研究頂空生成時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）對電子鼻傳感器響應信號的影響。對各傳感器達到響應信號峰值的時刻15 s進行分析，由表4可看出，頂空生成時間對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）；當頂空氣體達到平衡穩定后，由表5中電子鼻傳感器50 s響應值的方差分析結果可看出，頂空生成時間對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）。

圖3 不同頂空生成時間條件下電子鼻數據主成分分析圖Fig.3 PCA results of electronic nose responding data with different headspace-generated time

由圖3可看出，PCA分析結果中第一主成分占比78.89%，第二主成分占比18.63%，前兩個主成分總貢獻率占比97.52%，能充分的代表原始數據信息；且不同頂空生成時間的樣品基本可以區分開，其中20 min的樣品分布較為離散，聚集性差，20 min的樣品和15 min及10 min的樣品均有重疊，難以區分。頂空生成時間隨第一主成分減小的方向逐漸減小，隨第二主成分增加的方向先減小后增加。頂空生成時間為5 min和25 min時的樣品能與其他樣品區分開，但5 min時的數據點聚集效果較好，類內離差較小，因此選取5 min為最佳頂空生成時間。

2.2.4 載氣流速對電子鼻傳感器響應值的影響

將樣品稀釋30倍，取進樣體積5.0 mL、頂空生成時間5 min，研究載氣流速（200 mL/min、250 mL/min、300 mL/min、350 mL/min、400 mL/min）對電子鼻傳感器響應信號的影響。對各傳感器達到響應信號峰值的時刻15 s進行分析，由表4可以看出，載氣流速對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）；當頂空氣體達到平衡穩定后，由表5中電子鼻傳感器50 s響應值的方差分析結果可看出，載氣流速對S4、S7、S10影響不顯著（P＞0.05），對其他所有傳感器均有顯著影響（P＜0.05）。

由圖4可看出，PCA分析結果中第一主成分占比89.70%，第二主成分占比7.39%，前兩個主成分總貢獻率占比97.09%，能充分的代表原始數據信息。載氣流速隨第一主成分增加的方向先增加后減小。不同載氣流速的樣品基本可以區分開，其中200 mL/min、250 mL/min、400 mL/min有重疊，難以區分，300 mL/min既可以與其他數據區分，且聚集性較好，類內離差較小，因此選取300 mL/min為最佳載氣流速。

圖4 不同載氣流速條件下電子鼻數據主成分分析圖Fig.4 PCA results of electronic nose responding data with different flow rate of carrier gas

2.3 電子鼻定性識別不同蘋果酒

采用優化后的試驗參數對陜長富、魯長富、甘長富3種蘋果酒進行檢測分析，由圖5可知，PCA分析結果中第一主成分占比99.52%，第二主成分占比0.31%，前兩個主成分總貢獻率占比99.83%，能充分的代表原始數據信息。在此參數下，不同產地相同品種的蘋果酒可得到有效的區分。

圖5 不同蘋果酒的電子鼻數據主成分分析圖Fig.5 PCA results of electronic nose responding data with different varieties of apple wine

圖6為不同蘋果酒的香氣雷達圖，由圖6可知，W5S、W1S、W1W和W2S傳感器的響應最明顯，而其余6根傳感器無明顯變化。同時可根據傳感器響應信號強度的不同，直觀地判斷出3種蘋果酒樣品之間的風味物質基本相同，只是濃度大小有差異。結合表1和相關文獻[23]可知，W1W傳感器對硫化合物（如H2S）比較靈敏，對萜烯類以及有機硫化物也很敏感；W1S傳感器對甲基類香氣比較靈敏；W2S是對醇類香氣比較敏感的傳感器。因此可初步判斷，不同蘋果酒風味不同可能是因為酒中的氮氧化物、萜烯類物質、醇類物質及部分芳香族化合物含量有所差異。

圖6 電子鼻傳感器響應值的雷達圖Fig.6 Radar graph for response values of electronic nose sensors

2.4 電子舌最佳檢測條件的確定

采用電子舌技術，考察5種樣品稀釋倍數（10、15、20、25、30）對電子舌傳感器響應信號數據的影響，結果見圖7。由圖7可以看出，基于主成分分析法，分析結果第一主成分占比89.34%，第二主成分占比9.69%，這兩個主成分的總貢獻率為99.03%，電子舌能夠準確區分識別出不同稀釋倍數的蘋果酒，其中稀釋30倍的樣品聚集效果較好，類內離差較小，因此選取30倍為樣品最佳稀釋倍數。

圖7 不同樣品稀釋倍數條件下電子舌數據主成分分析圖Fig.7 PCA results of electronic tongue responding data with different sample diluted multiples

2.5 電子舌定性識別不同蘋果酒

采用優化后的試驗參數對陜長富、魯長富、甘長富3種蘋果酒進行檢測分析，由圖8可知，PCA結果中第一主成分占比98.24%，第二主成分占比1.07%，前兩個主成分總貢獻率占比99.31%，不同蘋果酒可以得到有效區分，表明3種蘋果酒的風味特征存在明顯差異。

對于不同蘋果酒樣間電子舌傳感器響應值的差異，圖9的雷達圖可以看得更清晰明了。其中不同酒樣間JB、GA、BB 傳感器響應值差別不大，而陜長富和魯長富的HA和JE傳感器響應值明顯小于甘長富，JE和HA傳感器是對酸味相當敏感的傳感器，說明陜長富和魯長富的酸味弱于甘長富；同時，陜長富和甘長富的CA和ZZ傳感器響應值明顯大于甘長富，CA和ZZ傳感器是對酸味和甜味相當敏感的傳感器，說明陜長富和甘長富的甜味強于甘長富。

圖8 不同蘋果酒的電子舌數據主成分分析圖Fig.8 PCA results of electronic tongue responding data with different varieties of apple wine

圖9 電子舌傳感器響應值的雷達圖Fig.9 Radar graph for response values of electronic tongue sensors

3 結論

本研究采用金屬氧化物傳感器陣列的電子鼻技術區分識別了不同的蘋果酒，采用單因素試驗研究了樣品稀釋倍數、頂空進樣體積、頂空生成時間和載氣流速4個因素對電子鼻響應值的影響，通過方差分析和主成分分析獲得了最佳檢測參數：樣品稀釋倍數30倍、頂空進樣體積5.0 mL、頂空生成時間5 min、載氣流速300 mL/min。研究了樣品稀釋倍數對電子舌傳感器的影響，結合主成分分析獲得了電子舌檢測蘋果酒樣品的最佳稀釋倍數為30倍。利用優化后的參數，電子鼻和電子舌均能很好的區分陜長富、甘長富、魯長富三種蘋果酒，二者結合能夠用于果酒風味的快速評價。