泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)劣化規(guī)律及其影響因素研究

趙 楠，葛黎紅，郭 壯，鄧 風(fēng)，賴海梅，王雅利，，黃玉立，，林長(zhǎng)彬，李 娟，朱永清

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；3.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053）

泡辣椒是我國(guó)傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的代表之一，以其鮮香爽脆、酸辣適口的感官特色，作為佐餐佳品深受南方消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝活動(dòng)是決定泡辣椒品質(zhì)好壞的關(guān)鍵[2]，如乳酸菌活躍的產(chǎn)酸代謝活動(dòng)主要賦予了泡辣椒的酸香滋味[3]；真菌具有豐富的蛋白、脂質(zhì)和糖類等降解酶系，可將大分子降解產(chǎn)生小分子增加產(chǎn)品滋味和風(fēng)味[4]。但是在泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中，微生物豐富的代謝酶系在產(chǎn)生滋味和風(fēng)味物質(zhì)的同時(shí)[2]，也能夠降解辣椒組織細(xì)胞壁中的果膠類物質(zhì)[5-7]，造成組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的坍塌，引起產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)軟爛，主要表現(xiàn)為泡辣椒產(chǎn)品硬度、脆度和咀嚼性的下降。

泡辣椒的質(zhì)構(gòu)由辣椒組織細(xì)胞壁的機(jī)械結(jié)構(gòu)完整度及細(xì)胞水分存在狀態(tài)共同決定，辣椒組織細(xì)胞壁的機(jī)械結(jié)構(gòu)完整度主要與環(huán)境pH、離子強(qiáng)度、果膠解酶活性等諸多因素有一定關(guān)系[1，8-10]。我國(guó)傳統(tǒng)泡辣椒的發(fā)酵周期在10～20 d，發(fā)酵進(jìn)程伴隨著泡辣椒的質(zhì)構(gòu)和理化特性的形成過(guò)程[2]。一方面，發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝過(guò)程通過(guò)改變環(huán)境（pH、離子強(qiáng)度）而間接影響泡辣椒組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)[11-12]；另一方面，微生物代謝產(chǎn)生的果膠降解酶系可通過(guò)降解植物細(xì)胞壁成分而直接影響辣椒組織結(jié)構(gòu)完整度，進(jìn)而影響泡辣椒質(zhì)構(gòu)變化過(guò)程[5]。盡管已有研究關(guān)注泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)劣化的現(xiàn)象，但其變化規(guī)律尚不清楚，且產(chǎn)品劣化過(guò)程與微生物發(fā)酵以及理化指標(biāo)的變化之間的關(guān)系還不明確。

本研究在考察泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)、微生物數(shù)量及理化性質(zhì)變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，采用相關(guān)性分析方法對(duì)質(zhì)構(gòu)與微生物數(shù)量及理化指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，以明確泡辣椒在發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)構(gòu)劣化規(guī)律及其與微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅辣椒：襄陽(yáng)市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；食鹽（食用級(jí)）：四川省鹽業(yè)總公司；氫氧化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠酶活性檢測(cè)試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；MRS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S型分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FiveEasy PlusTMFE20K型pH計(jì)、MB27型水分活度儀、HE53型快速水分蒸發(fā)儀：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NMI20-025V-I核磁共振分析儀：上海紐邁電子科技有限公司；TA.XTPlus型物性分析儀：英國(guó)Stable Micro System有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵辣椒制備

向泡菜壇中加入1 800 mL 4%氯化鈉溶液、400 g鮮辣椒，將泡菜壇水封后放入25 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)酵，分別在第0、2、4、6、8、10、12、14、16天取辣椒樣品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)（硬度、脆性、咀嚼性）、微生物指標(biāo)（乳酸菌、真菌數(shù)量）及理化指標(biāo)（pH值、水分含量、水分活度、水分分布、果膠酶活力）的測(cè)定，平行試驗(yàn)3次。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)剖面分析

選取泡辣椒樣品，將辣椒切成3段，選取中間一段作為測(cè)試對(duì)象。測(cè)試條件[1]：探頭型號(hào)P2，測(cè)前速度1 mm/s，測(cè)試速度1 mm/s，測(cè)后速度2 mm/s，穿刺距離15 mm。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定8次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 微生物指標(biāo)

于無(wú)菌條件下取泡辣椒樣品5 g，加入45 mL無(wú)菌水，均質(zhì)，梯度稀釋后選取適宜梯度樣品液，分別涂布于MRS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基平板置于厭氧條件下37 ℃培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)為乳酸菌數(shù)量，孟加拉紅培養(yǎng)基平板于30 ℃培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)為真菌數(shù)量[13]。

1.3.4 理化指標(biāo)

pH值[13]：取鹵水10 mL，采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

水分含量[14]：將泡辣椒剪成小片，稱取3 g樣品裝入樣品盒中，采用快速水分蒸發(fā)儀測(cè)定；水分活度（water activity，Aw）[14]：采用水分活度儀進(jìn)行測(cè)定；水分存在形式[14]：準(zhǔn)確稱取2 g泡辣椒樣品于試管中，采用低場(chǎng)核磁共振分析儀檢測(cè)，用PQ001分析軟件及Q-CPMG序列采集泡辣椒T2信號(hào)。測(cè)定參數(shù)：等待時(shí)間3 000 ms，回波時(shí)間0.8 ms，前置放大倍數(shù)1，回波個(gè)數(shù)10 000，累加次數(shù)8。

果膠酶活力[15]：取1 g泡辣椒樣品，采用果膠酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.3.5 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)變化

圖1 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中硬度（A）、脆度（B）和咀嚼性（C）的變化Fig.1 Changes in hardness (A),crispness (B) and chewiness (C) of pickled pepper during the fermentation process

泡辣椒的質(zhì)構(gòu)是影響消費(fèi)者接受度的重要指標(biāo)之一，在質(zhì)構(gòu)剖面分析中，硬度、脆度和咀嚼性是評(píng)價(jià)泡辣椒質(zhì)構(gòu)的主要指標(biāo)。泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)的變化結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，鮮辣椒經(jīng)發(fā)酵后硬度和咀嚼性均明顯下降，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為16 d時(shí)，泡辣椒的硬度和咀嚼性分別下降24.49%和36.81%，表明泡辣椒在發(fā)酵過(guò)程中組織逐漸軟化。在脆度方面，發(fā)酵過(guò)程使得泡辣椒脆度顯著上升（P＜0.05），當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為8 d時(shí)，脆度為4.36 g，是鮮辣椒的1.90倍；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞8 d之后，脆度上升趨勢(shì)減緩；當(dāng)發(fā)酵16 d時(shí)，脆度為5.36 g，是鮮辣椒的2.56倍。該結(jié)果與已有研究對(duì)辣椒發(fā)酵后脆度變化的報(bào)道結(jié)果不一致[1]，這可能與食鹽添加量的差異有關(guān)，已有研究的食鹽添加量在5%～25%，本研究中較低的食鹽添加量有助于脆度的保持。此外，BUESCHER R W等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在酸黃瓜泡菜中，隨發(fā)酵體系乳酸含量增加，蔬菜果皮中的果膠變性程度加劇，發(fā)酵蔬菜脆度也將上升，這與本研究結(jié)果相一致。

2.2 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中微生物變化

泡辣椒發(fā)酵是微生物代謝活動(dòng)的結(jié)果，微生物不僅可通過(guò)代謝過(guò)程改變體系環(huán)境而影響組織細(xì)胞壁狀態(tài)，還能夠通過(guò)產(chǎn)生果膠降解酶系來(lái)直接影響泡辣椒質(zhì)構(gòu)。其中，乳酸菌是泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中的主要產(chǎn)酸微生物[17]，其在泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中的變化見(jiàn)圖2A。由圖2A可知，在發(fā)酵0～2d，乳酸菌迅速增殖，當(dāng)發(fā)酵2d時(shí)，乳酸菌數(shù)量增長(zhǎng)至8.20lgCFU/g。當(dāng)發(fā)酵2 d后逐漸趨向穩(wěn)定。

圖2 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌總數(shù)（A）和真菌總數(shù)（B）變化Fig.2 Changes in total lactic acid bacteria (A) and fungi (B) count in pickled pepper during the fermentation process

除乳酸菌外，發(fā)酵作用的另一類微生物是真菌[2]，真菌在發(fā)酵系統(tǒng)所占比例較低，但是真菌可產(chǎn)生豐富的酶系，將泡辣椒組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、多糖等大分子降解，從而加速泡辣椒的質(zhì)構(gòu)軟化[18]，其在泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中的變化見(jiàn)圖2B。由圖2B可知，在泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中，在發(fā)酵0～2 d，真菌迅速增殖，當(dāng)發(fā)酵2 d時(shí)，真菌數(shù)量增長(zhǎng)至4.12 lgCFU/g；當(dāng)發(fā)酵2 d后迅速下降至不可察。這表明真菌的作用時(shí)間主要發(fā)生在發(fā)酵前期。

2.3 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中理化性質(zhì)的變化

2.3.1 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中pH值變化

泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化見(jiàn)圖3。由圖3可知，在發(fā)酵0～2 d，泡辣椒的pH值迅速下降，分析原因可能是乳酸菌的迅速增殖通常伴隨著酸性代謝物的大量積累，導(dǎo)致泡辣椒pH值在前2天內(nèi)迅速下降；當(dāng)發(fā)酵4 d時(shí)，pH值降至4.10。當(dāng)發(fā)酵4 d后，pH值趨于穩(wěn)定，分析原因可能是體系pH值下降后，體系中微生物的生長(zhǎng)受到抑制，低pH值對(duì)產(chǎn)酸代謝具有抑制作用，產(chǎn)酸代謝減緩后，在體系中一些緩沖性代謝物的作用下，pH值趨于穩(wěn)定[13]。

圖3 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中pH值變化Fig.3 Changes in pH of pickled pepper during the fermentation process

2.3.2 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中水分含量、水分活度和水分存在狀態(tài)變化

辣椒組織細(xì)胞中的水分含量以及細(xì)胞壁與周圍水分的相互作用狀態(tài)都可影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響組織機(jī)械結(jié)構(gòu)以及泡辣椒產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性。泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中水分含量、水分活度和水分分布變化見(jiàn)圖4。

由圖4A可知，在發(fā)酵過(guò)程中，泡辣椒的水分含量呈先逐漸下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵8 d時(shí)，水分含量下降5.60%；當(dāng)發(fā)酵8 d后，水分含量趨于穩(wěn)定。這可能是由于在發(fā)酵0～8 d，4%食鹽形成了高滲環(huán)境，導(dǎo)致組織細(xì)胞失水皺縮；在發(fā)酵8 d后，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓逐漸平衡，泡辣椒水分含量趨于平穩(wěn)。

由圖4B可知，在發(fā)酵過(guò)程中，泡辣椒水分活度呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵2 d時(shí)，水分活度下降6.00%；當(dāng)發(fā)酵2 d后，水分活度趨于穩(wěn)定，這可能是由于體系pH穩(wěn)定后，食鹽滲透作用減弱，辣椒的失水作用逐漸停止[14]。

圖4 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中水分含量（A）、水分活度（B）和水分分布（C）變化Fig.4 Changes in water content (A),water activity (B) and water distribution(C)of pickled pepper during the fermentation process

泡辣椒組織細(xì)胞中的結(jié)合水與組織細(xì)胞中的大分子通過(guò)相互作用結(jié)合，不易流動(dòng)水主要位于組織細(xì)胞內(nèi)部，流動(dòng)受到阻滯。而自由水則處于游離狀態(tài)，是植物組織細(xì)胞的水分中最容易失去的一種。低場(chǎng)核磁共振技術(shù)主要用于考察樣品中結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水的含量和比例分布情況[19]。由圖4C可知，結(jié)合水所占比例隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而下降，而不易流動(dòng)水的比例明顯增加，相對(duì)應(yīng)的是自由水比例的略微下降。在樣品水分含量變化幅度較小的情況下，發(fā)酵過(guò)程中樣品水分活度的下降可能是由于發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程使得環(huán)境pH值下降，組織細(xì)胞內(nèi)外部的蛋白質(zhì)、多糖等大分子帶電量增加，與水分子結(jié)合的能力增強(qiáng)。另一方面，食鹽所形成的高滲環(huán)境造成細(xì)胞失去自由水，且在泡辣椒腌制過(guò)程中食鹽也將通過(guò)滲透作用進(jìn)入辣椒組織細(xì)胞中，可進(jìn)一步通過(guò)改變大分子的帶電量而影響其與水分子的結(jié)合狀態(tài)[20]。這些因素共同作用將引起泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中自由水和結(jié)合水的比例下降，相應(yīng)的，不易流動(dòng)水的比例上升，這一現(xiàn)象與水分活度結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

2.3.3 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中總果膠酶活力變化

在發(fā)酵過(guò)程中，辣椒組織細(xì)胞中的內(nèi)源性果膠降解酶系[21]以及微生物代謝產(chǎn)生的外源性果膠降解酶系[7]均可能通過(guò)降解果膠成分，直接導(dǎo)致泡辣椒軟化。泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中總果膠酶活力變化見(jiàn)圖5。由圖5可知，在發(fā)酵過(guò)程中，泡辣椒的總果膠酶活力呈先升高后下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在發(fā)酵2 d時(shí)，總果膠酶活力迅速上升68.32%。分析原因可能是微生物的旺盛代謝產(chǎn)生了大量果膠酶，內(nèi)源性果膠酶因食鹽高滲環(huán)境的存在而被釋放出來(lái)，導(dǎo)致酶量增加。此外，發(fā)酵前期的微酸性環(huán)境也對(duì)果膠酶具有激活作用，這兩方面因素均可能在一定程度上促進(jìn)酶活力上升。而發(fā)酵2 d后，總果膠酶活力逐漸下降，發(fā)酵10 d時(shí)，總果膠酶活力下降至初始值的42.31%。分析原因可能是在發(fā)酵形成的低酸（pH值4.10）和高滲（4%食鹽）條件的共同作用下，果膠酶活性受到明顯抑制[22]，這一現(xiàn)象與pH值變化結(jié)果相對(duì)應(yīng)。在發(fā)酵10 d后，總果膠酶活力趨于穩(wěn)定。

圖5 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中總果膠酶活力變化Fig.5 Changes in total pectinase activity of pickled pepper during the fermentation process

2.4 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)形成與微生物指標(biāo)及理化特性之間的相關(guān)性

采用皮爾遜相關(guān)性分析法對(duì)泡辣椒理化性質(zhì)和微生物數(shù)量指標(biāo)與質(zhì)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，泡辣椒樣品的硬度、脆度和咀嚼性與總果膠酶活力、水分含量、結(jié)合水占比、不易移動(dòng)水占比以及自由水比例之間均具有顯著相關(guān)性。pH值主要與泡辣椒的硬度和咀嚼性具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），但其與產(chǎn)品脆度相關(guān)性不大（P＞0.05）。對(duì)于微生物指標(biāo)，乳酸菌的數(shù)量與硬度和咀嚼性顯著相關(guān)（P＜0.05），但與脆度相關(guān)性不大（P＞0.05）。而真菌的數(shù)量主要與脆度和咀嚼性顯著相關(guān)，與樣品硬度無(wú)明顯相關(guān)（P＞0.05）。由此可知，泡辣椒樣品的質(zhì)構(gòu)主要與總果膠酶活力、水分含量及水分存在狀態(tài)有關(guān)。在后續(xù)研究中，應(yīng)著重開(kāi)展總果膠酶活力、水分含量及水分存在狀態(tài)與泡辣椒產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)品質(zhì)形成機(jī)制方面的研究。

表1 泡辣椒發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)與理化性質(zhì)及微生物指標(biāo)之間的皮爾遜相關(guān)性系數(shù)Table 1 Pearson's correlation coefficients between texture and physicochemical properties,microbial indicator of pickled pepper during fermentation

3 結(jié)論

在發(fā)酵過(guò)程中，泡辣椒的硬度、咀嚼性下降，脆度上升。在發(fā)酵前2天，乳酸菌及真菌迅速增殖，總果膠酶活力升高，pH值迅速下降；發(fā)酵2 d后，乳酸菌數(shù)量、pH值趨于穩(wěn)定，真菌下降并逐漸消失，總果膠酶活力迅速下降后趨于穩(wěn)定。由于環(huán)境中酸和鹽的共同作用，泡辣椒釋放自由水，水分含量下降，且部分自由水轉(zhuǎn)化為不易移動(dòng)水，水分活度下降。相關(guān)性分析結(jié)果表明，泡辣椒硬度、脆度和咀嚼性質(zhì)構(gòu)指標(biāo)主要與總果膠酶活力、水分含量及水分存在狀態(tài)顯著相關(guān)（P＜0.05）。