人參豆豉的發酵工藝及人參皂苷生物轉化研究

陳麗艷，崔貝貝，孫銀玲，陳繼亮，曹 陽，鄭宏宇，王 萍，王偉明

（黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036）

豆豉為我國傳統大豆發酵食品，具有較高的營養價值和食療作用，通常是在自然條件下由多菌種混合發酵制得，因生產環境、輔料及制備工藝等不同，制得的豆豉風味和生理活性物質含量也不盡相同[1-3]。中藥淡豆豉是大豆與青蒿、桑葉或紫蘇、麻黃等經發酵加工制成，因發酵時加入不同藥材而產生不同的藥性[4-5]。豆豉和中藥淡豆豉中均含有豆豉纖溶酶，能有效溶解血栓并抑制血栓形成，且安全無毒副作用[6-7]。

心腦血管疾病患者常伴有氣虛血瘀，因此溶栓的同時需兼顧補氣，而人參（Panax ginsengC.A.Mey.）為首選的補氣中藥，常用于氣血兩虛證，既能補氣以行血，又有一定的活血之功，可用治血脈瘀滯諸證[8]。另外，衛生部2012年第17號公告已批準人參（人工種植）為新資源食品，并規定了人參的食用量，為人參在食療產品的應用提供依據。另據報道，一些人參皂苷成分口服生物利用度低，需經腸道微生物轉化為次級苷或苷元而發揮更強的藥理作用[9-10]，已有學者在體外利用微生物發酵實現人參皂苷的生物轉化[11-12]。

目前，尚鮮見在豆豉的制備中加入人參的相關報道，本研究以人參和黃豆為發酵基質，利用從淡豆豉中分離篩選的優勢菌種純種發酵制備人參豆豉（參豉），以期增加豆豉的益氣活血作用，并實現人參皂苷的體外生物轉化，提高生物利用度。以纖溶酶活性為評價指標，通過發酵菌株、人參與黃豆的質量比、人參的加入方式、發酵溫度及發酵時間的考察以確定參豉的最佳發酵工藝，并利用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析發酵前后人參皂苷的變化，為參豉作為食療產品的應用及質量標準的建立提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黃豆：由黑龍江省農業科學院提供，2017年種植采收，為豆科植物大豆[Glycine max（Linn.）Merr]的干燥成熟種子。人參：由吉林省百濟堂參業有限公司提供，種植5年，2017年采收，為五加科植物人參的干燥根。

1.1.2 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DC-1、傘枝梨頭霉（Absidia corymbifera）DC-11：分離自淡豆豉飲片（黑龍江產地和山東產地），保存至黑龍江省中醫藥科學院中藥所生物工程研究室；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GB-1、GB-2、GB-3、GB-4（標準菌株）：中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.3 試劑

人參皂苷對照品Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh1、Rck（純度均≥98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；尿激酶標準品、纖維蛋白原、凝血酶原：中國食品藥品檢定研究院；薄層硅膠G：青島海洋化工有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜級）：美國TTEDIA試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-2N凈化工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；MF3多功能一體機：杭州迅數科技有限公司；DHP-9272恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；e2695-2489高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 參豉發酵工藝

將黃豆按照1∶1.2（g∶g）的比例加蒸餾水（或人參提取液）浸泡，待溶液吸盡，裝袋，于121 ℃高壓滅菌40 min，室溫放置，作為發酵基質。按照2%（V/V）的接種量接種各發酵菌液（106～108CFU/mL），搖勻，培養，即得參豉發酵產品。

1.3.2 參豉發酵工藝優選

以纖溶酶活性為評價指標，考察不同菌株、黃豆與人參比例、人參加入方式、發酵溫度及發酵時間對纖溶酶活性的影響，確定最優發酵工藝。

發酵菌株的篩選：黃豆與人參比例為10∶1（g∶g），人參加水提取，將菌株DC-1、GB-1、GB-2、GB-3、GB-4、DC-11和DC-1+DC-11復合菌分別作為發酵菌，其中菌株DC-1、GB-1、GB-2、GB-3、GB-4于37 ℃條件下恒溫培養48 h；菌株DC-11和DC1+DC11復合菌于28 ℃條件下恒溫培養120 h。

黃豆與人參比例的考察：調整黃豆與人參質量比分別為50∶0、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1作為發酵基質，人參加水提取，以菌株DC-1為發酵菌，于37 ℃條件下恒溫培養48 h。

人參加入方式的考察：黃豆與人參的比例10∶1，人參以3種方式加入：（1）將黃豆加水浸泡后瀝干加入人參粉末拌勻；（2）將人參加蒸餾水煎煮2次，每次1 h，濾液浸泡黃豆；（3）先將人參用體積分數70%乙醇回流提取1 h，濾液回收乙醇，濾渣再加蒸餾水煎煮1 h，合并兩次濾液浸泡黃豆。以菌株DC-1為發酵菌，于37 ℃條件下恒溫培養，分別在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h取樣，測定纖溶酶活性。

發酵溫度的考察：黃豆與人參質量比10∶1，人參加水提取，以菌株DC-1為發酵菌，分別于25 ℃、28 ℃、33 ℃、37 ℃、40 ℃條件下恒溫培養96 h，測定纖溶酶活性。

1.3.3 纖溶酶活性的測定

參照王萍等[13]纖溶酶活性的測定方法制備纖維蛋白原平板和配制酶活力分別為80 IU/mL、60 IU/mL、40 IU/mL、20 IU/mL、10 IU/mL的尿激酶標準溶液。取2 g樣品加0.9%氯化鈉溶液10 mL，研磨、過濾，分別取各樣品濾液及尿激酶標準溶液各10 μL，點于纖維蛋白平板上，于37 ℃溫育18 h，測定溶圈面積。以尿激酶溶圈面積（y）為縱坐標，酶活力（x）為橫坐標，繪制尿激酶標準曲線（y=1.722 1x+9.255 9，R2=0.9906），根據標準曲線回歸方程計算樣品的纖溶酶活性。

1.3.4 薄層色譜分析

供試品溶液的制備：參照《中國藥典》并稍作修改[4]。取最優發酵工藝制備的參豉樣品干燥、粉碎，過3號篩，取10 g粉末（10 g參豉樣品相當于含1 g人參），以同法處理的未接種發酵基質為對照，分別加入三氯甲烷40 mL，加熱回流3 h，過濾，藥渣揮干溶劑，加水飽和的正丁醇50 mL，超聲處理30 min，過濾。濾液加3倍體積的氨試液，搖勻，放置分層，收集上層溶液并蒸干，加入1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

對照品溶液的制備：精密稱取人參皂苷對照品Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh1、Rck，加甲醇，分別制成質量濃度為2 g/L的對照品混合溶液。

采用薄層色譜法[4]，吸取上述人參皂苷對照品溶液和供試品溶液各2 μL，分別點于同一薄層硅膠G板。以10 ℃以下放置的三氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10，V/V）下層溶液為展開劑，于4 ℃展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下觀察。

1.3.5 高效液相色譜分析

參照《中國藥典》對參豉中人參皂苷進行定量分析[4]。采用甲醇將1.3.4中的對照品混合溶液稀釋10倍，得到質量濃度為0.2 g/L的對照品溶液。以未接種發酵基質為對照，取最優發酵工藝制備的參豉樣品粉末10 g進行HPLC分析。HPLC條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）和水（B），洗脫梯度為0～35 min，A為19%；35～55 min，A為19%～29%；55～70 min，A為29%；70～110 min，A為29%～40%。流速1 mL/min，檢測波長203 nm。

1.3.6 數據分析

采用Graphpad Prism 6.0軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 參豉發酵工藝的確定

2.1.1 發酵菌株的篩選

不同發酵菌株對參豉纖溶酶活力的影響見圖1。

圖1 不同菌株對參豉纖溶酶活性的影響Fig.1 Effect of different strains on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi

由圖1可知，不同菌株發酵參豉的纖溶酶活性大小排序為菌株DC-1＞GB-1＞DC-11+DC-11＞GB-3＞GB-2＞GB-4＞DC-11，其中枯草芽孢桿菌DC-1發酵參豉的纖溶酶活性最高，為（478.95±3.50）IU/g。已有研究表明，枯草芽孢桿菌為豆豉的主發酵菌，也是產豆豉纖溶酶的主要菌[14]。菌株DC-1和GB-1、GB-2、GB-3、GB-4雖均為枯草芽孢桿菌，但纖溶酶活性明顯存在差異（P＜0.05），說明同一菌種不同菌株產纖溶酶能力存在差異。菌株DC-11為傘枝梨頭霉，在酒曲中普遍存在，可改善酒的風味和口感[15]，該菌已用于人參皂苷、黃芪皂苷的微生物轉化[16-17]。由于淡豆豉傳統自然發酵為多菌種混合發酵而成，菌株DC-1和DC-11均分離自淡豆豉飲片，因此本研究中也利用這兩種菌復合菌發酵制備參豉進行對比研究。結果表明，最佳發酵菌株為DC-1。

2.1.2 黃豆與人參比例的確定

黃豆與人參比例對參豉纖溶酶活力的影響見圖2。

圖2 黃豆與人參比例對參豉纖溶酶活性的影響Fig.2 Effect of soybean to ginseng ratio on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi

由圖2可知，隨著人參加入量的升高，參豉纖溶酶活性呈現先升高后降低的趨勢，當黃豆與人參比例為10∶1（g∶g）時，纖溶酶活性最高，為（495.02±19.24）IU/g。分析原因可能是人參在低質量濃度時促進而高質量濃度時抑制菌株DC-1的生長，進而影響纖溶酶活性。因此，確定黃豆與人參最佳比例為10∶1（g∶g）。

2.1.3 人參添加方式及發酵時間的確定

人參添加方式及發酵時間對參豉纖溶酶活力的影響見圖3。

圖3 人參添加方式及發酵時間對參豉纖溶酶活性的影響Fig.3 Effect of ginseng addition mode and fermentation time on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi

由圖3可知，人參以水提液和先醇提再水提的方式加入后發酵96 h時，纖溶酶活性均達到最高，分別為（492.95±36.25）IU/g和（498.07±35.12）IU/g，且優于以粉末形式加入，從工藝過程考慮，人參采用水提液方式加入，發酵時間96 h。

2.1.4 發酵溫度的確定

發酵溫度對參豉纖溶酶活力的影響見圖4。

圖4 發酵溫度對參豉纖溶酶活性的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi

由圖4可知，發酵溫度為25 ℃時，纖溶酶活力較低，分析原因可能是該菌生長比較緩慢所致；發酵溫度為28 ℃時，參豉纖溶酶活性最高，為（498.90±28.33）IU/g；發酵溫度高于28 ℃之后，纖溶酶活性呈下降趨勢，40 ℃時下降明顯，表明DC-1菌的生長受溫度的影響較大，進而影響酶的生物量。

綜上所述，以纖溶酶活性為考察指標，確定參豉最佳發酵工藝：優勢發酵菌株為枯草芽孢桿菌DC-1，黃豆與人參比例為10∶1（g∶g），人參以水提液的方式加入，于28 ℃發酵96 h。

2.2 薄層色譜分析結果

《中國藥典》中僅以Rg1、Rf、Re、Rb1為對照進行人參的鑒別[4]，本研究增加了稀有人參皂苷Rck、Rh1和Rc為對照品，為分析人參皂苷多種成分的轉化提供依據。7種人參皂苷的薄層色譜分析結果見圖5。

圖5 參豉中人參皂苷薄層色譜分析結果Fig.5 Result of ginsenoside in ginseng-Douchi analyzed by thin layer chromatogram

由圖5可知，7種人參皂苷對照品薄層色譜斑點分離度較好，表明該方法適用于這7種人參皂苷的分離。參豉發酵前后均含有7種人參皂苷，但發酵后人參皂苷Rh1和Rf斑點顏色變淡，可能是由于這兩種成分發生了生物轉化。參豉發酵前后樣品的在Rc和Rb1斑點較密集，沒有明顯分開，可能是由于大豆中的成分干擾所致，需結合高效液相色譜結果進一步分析。

2.3 高效液相色譜結果

發酵前后參豉的HPLC見圖6，7種人參皂苷含量的變化見表1。

由圖6可知，除人參皂苷Rck在此色譜條件下未顯示單一的色譜峰外，其他6種人參皂苷對照品分離度均較好。由表1可知，未接種基質中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1和Rc的含量分別為0.185 2 mg/g、0.355 8 mg/g、0119 8 mg/g、0.116 0 mg/g、0.071 6 mg/g和0.585 7 mg/g，發酵后分別為0.050 0 mg/g、0.095 5 mg/g、0.043 3 mg/g、0.039 0 mg/g、0.024 0 mg/g和0.156 0 mg/g，發酵后6種人參皂苷成分均下降60%以上，表明這6種成分在微生物酶作用下發生了生物轉化。未接種基質在38.29 min出現一個色譜峰，但發酵后消失，且在36.98 min出現了一個新化合物，可能是此種成分轉化而得。除6種人參皂苷外，在80 min后也有幾種物質峰面積下降，可能是其他人參皂苷成分發生了降解。目前已經從人參屬植物中分離得到150多種人參皂苷[18]，《中國藥典》僅以人參皂苷Rg1、Re、Rb1三種對照品測定其含量，本研究又增加了Rf、Rh1和Rc對照品，但仍存在一定局限性，因為不同人參皂苷的結構不同，不能采用同一種方法把所有人參皂苷都提取分離并檢測出來。

圖6 人參皂苷對照品（A）及發酵前后參豉樣品（B）的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC of ginsenoside reference substance (A) and ginseng-Douchi (B) before and after fermentation

表1 參豉發酵前后6種人參皂苷含量的變化Table 1 Changes of 6 kinds of ginsenoside in ginseng-Douchi before and after fermentation

在已有報道中，人參皂苷的生物轉化多以一種或幾種人參皂苷單體成分進行轉化[19-20]，不受其他基質成分的干擾，更易于轉化成分的分析。參豉中人參的加入量僅為黃豆質量的1/10，在樣品制備及檢測過程中可能受黃豆中的一些成分干擾，且人參以水提液的方式加入，使人參皂苷成分不能完全提取出來，分析轉化產物的成分相對也比較復雜。人參水提液中除含有人參皂苷外，人參多糖在降糖、增強免疫、抗氧化等方面也發揮了重要作用[21-22]。經典名方“獨參湯”是以水煎液口服入藥，ZHOU S S等[23]研究表明，獨參湯可通過人參多糖對腸道菌群的調節作用促進人參皂苷的轉化；李瑞剛等[24]研究也證實人參多糖能促進人參皂苷Re轉化為人參皂苷Rg1。本研究僅基于6種人參皂苷成分對參豉發酵前后人參皂苷的含量變化進行分析，對于其他人參皂苷的轉化情況尚需通過大量的實驗進一步研究。

3 結論

本研究利用淡豆豉的發酵原理，將黃豆輔以人參發酵制備一種具有高纖溶活性的參豉。通過發酵菌株的篩選、人參的加入量和加入方式、發酵溫度及發酵時間的考察確定了參豉的最佳發酵工藝：優勢發酵菌株為枯草芽孢桿菌DC-1，黃豆與人參比例為10∶1（g∶g），人參以水提液的方式加入，于28 ℃發酵96 h。此優化條件下參豉的纖溶酶活力達到（498.90±28.33）IU/g。同時，通過微生物發酵實現了多種人參皂苷的體外生物轉化，轉化率達60%以上。本研究為參豉后續益氣活血作用研究及質量標準建立提供依據，也為開發具有保健作用的食療產品奠定基礎。