直投式納豆菌發(fā)酵劑制備工藝優(yōu)化

魯 青，嚴美婷，張超鳳，張 良

（江西省食品發(fā)酵研究所，江西 宜春 336000）

納豆菌（Bacillus natto）是從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離出來的無病原性的安全菌株[1]，其發(fā)酵作用能使蛋白質等營養(yǎng)成分分解為更利于消化吸收的小分子化合物[2-3]，并產生納豆激酶等多種生理活性物質，從而使發(fā)酵食品表現(xiàn)出獨特的營養(yǎng)特點和生理功能[4-7]。故長期以來納豆菌在食品發(fā)酵領域占領著重要的位置，成為研究的熱點。

直投式納豆菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能強，使用方便，其不僅能簡化納豆制品生產工藝，還可防止菌種退化及污染，有利于保證產品質量的穩(wěn)定[8-11]。但目前直投式納豆菌發(fā)酵劑的制備技術較復雜，一般要先將納豆菌高密度培養(yǎng)后收集菌體，再添加保護劑后通過噴霧干燥或真空冷凍干燥而成[12-14]，制備工藝復雜、周期長、成本高。因此尋找工藝簡便、成本低的直投式納豆菌發(fā)酵劑制備技術是研究的重要方向。

本研究以大米粉為基質替代傳統(tǒng)的液態(tài)種子液培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)納豆菌，通過單因素試驗及正交試驗優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并將培養(yǎng)物直接烘干制成納豆菌發(fā)酵劑，以期得到一種活菌數(shù)高、發(fā)酵活力強且制備簡便、生產成本低的直投式納豆菌發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆菌（Bacillus natto）（CICC 10023）：江西省食品發(fā)酵研究所微生物實驗室；大米粉：市售；蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；尿素、硫酸銨（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[15]：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7.4，121 ℃滅菌20 min。大米粉培養(yǎng)基[16]：將過80目篩的大米粉裝入三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ML204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QYC-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZF-75KB高壓滅菌鍋、GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱：上海申安醫(yī)療器械廠；DH3600電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 直投式納豆菌發(fā)酵劑制備工藝流程及操作要點

培養(yǎng)基制備→種子液制備→接種→發(fā)酵培養(yǎng)→烘干→發(fā)酵劑

操作要點：

（1）培養(yǎng)基的制備：向滅菌的大米粉培養(yǎng)基中添加適量的氮源，再加入適量無菌水，混勻、備用。

（2）種子液：將納豆菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在35 ℃、150 r/min條件下活化16 h，即得種子液[17]。

（3）接種、發(fā)酵培養(yǎng)：將納豆菌種子液按一定的接種量接入制備好的培養(yǎng)基中，在一定溫度靜置發(fā)酵培養(yǎng)一段時間。

（4）烘干：將培養(yǎng)物裝入無菌信封中，置于烘箱中先以45 ℃干燥6 h，再以60 ℃干燥12 h，拍散，即得直投式納豆菌發(fā)酵劑。

1.3.2 氮源種類對納豆菌生長的影響

以大米粉為基質增殖納豆菌，向大米粉培養(yǎng)基中分別添加1.0%的大豆蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨，再加入35%無菌水，以3%（V/V）的接種量接入納豆菌種子液，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，將其裝入無菌信封中，置于烘箱中烘干制成直投式納豆菌發(fā)酵劑。采用平板菌落計數(shù)法[14]測定發(fā)酵劑中納豆菌活菌數(shù)，考察氮源種類對納豆菌生長的影響。

1.3.3 氮源含量對納豆菌生長的影響

在最佳氮源條件下，向大米粉培養(yǎng)基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的氮源，其他條件保持不變，對納豆菌進行培養(yǎng)，并烘干制成直投式納豆菌發(fā)酵劑。測定發(fā)酵劑中納豆菌活菌數(shù)，以確定最佳氮源含量。

1.3.4 直投式納豆菌發(fā)酵劑發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

選取最適氮源及其含量添加于大米粉培養(yǎng)基中，接入納豆菌種子液，在一定條件下進行固態(tài)擴大培養(yǎng)，分別考察接種量（2%、3%、4%、5%、6%）、加水量（25%、30%、35%、40%、45%）、培養(yǎng)時間（20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h）、培養(yǎng)溫度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）對納豆菌生長的影響。將培養(yǎng)物烘干制成直投式納豆菌發(fā)酵劑，測定發(fā)酵劑中納豆菌活菌數(shù)，以確定最佳培養(yǎng)條件。

1.3.5 直投式納豆菌發(fā)酵劑發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

以單因素試驗為基礎，選取對納豆菌生長影響較大的接種量（A）、加水量（B）、培養(yǎng)溫度（C）及培養(yǎng)時間（D）4個因素進行正交試驗，以發(fā)酵劑中納豆菌活菌數(shù)為評價指標，得到最佳直投式納豆菌發(fā)酵劑制備工藝。正交試驗因素與水平見表1。

表1 直投式納豆菌發(fā)酵劑發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of directed vat set Bacillus natto starter culture

1.3.6 數(shù)據處理

每個試驗做3個平行，結果取平均值，并采用DPS v6.55和Excel 2007軟件處理分析試驗數(shù)據。

2 結果與分析

2.1 氮源種類對納豆菌活菌數(shù)的影響

圖1 氮源種類對納豆菌活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of nitrogen source types on the viable count of Bacillus natto

由圖1可知，不同種類的氮源對納豆菌生長的影響不同，與對照組（未添加氮源的大米粉培養(yǎng)基）相比，有機氮源的添加促進了納豆菌的生長，其中以添加了蛋白胨的大米粉培養(yǎng)基培養(yǎng)納豆菌得到的活菌數(shù)最多，干燥后制成的發(fā)酵劑中活菌數(shù)達6.86×108CFU/g，而無機氮源不利于納豆菌的生長，活菌數(shù)較低，這與李情敏等[17]的研究結果一致。因此，確定最佳氮源為蛋白胨。

2.2 蛋白胨添加量對納豆菌活菌數(shù)的影響

圖2 蛋白胨添加量對納豆菌活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of peptone addition on the viable count of Bacillus natto

由圖2可知，隨著大米粉中蛋白胨添加量的增加，納豆菌活菌數(shù)呈先增大后減小的趨勢，當?shù)鞍纂颂砑恿繛?.5%時，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質豐富，菌體生長旺盛，將培養(yǎng)物烘干后制成的發(fā)酵劑中活菌數(shù)最高，達9.04×108CFU/g。因此，確定最佳蛋白胨添加量為1.5%。

2.3 接種量對納豆菌活菌數(shù)的影響

圖3 接種量對納豆菌活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of inoculum on the viable count of Bacillus natto

由圖3可知，不同接種量對納豆菌生長的影響不同，隨著接種量的增大，納豆菌活菌數(shù)呈先增大后減小的趨勢，分析原因可能是接種量過小，遲緩期延長，菌體生長代謝慢，接種量過大，菌體生長過快，造成菌體提前衰亡[18]，活菌數(shù)降低。當接種量為4%時，最有利于納豆菌的生長，活菌數(shù)達最高，為1.17×109CFU/g。因此，確定最佳接種量為4%。

2.4 加水量對納豆菌活菌數(shù)的影響

圖4 加水量對納豆菌活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of water addition on the viable count of Bacillus natto

由圖4可知，隨著加水量的增加，納豆菌活菌數(shù)呈先增大后減小的趨勢，其原因可能為加水量過小時，納豆菌能利用的水分過少，抑制了納豆菌的生長繁殖，而加水量過大時，氧氣供應量不足，造成納豆菌生長狀況不佳[19]，當加水量為35%時，菌體生長最旺盛，活菌數(shù)最高，為9.04×108CFU/g。因此，確定最佳加水量為35%。

2.5 培養(yǎng)時間對納豆菌活菌數(shù)的影響

由圖5可知，培養(yǎng)時間對納豆菌的生長影響較大，培養(yǎng)時間＜32 h之前，納豆菌活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，活菌數(shù)反而降低，可能是由于培養(yǎng)時間過長，代謝產物積累，造成菌體死亡。當培養(yǎng)時間為32 h時，活菌數(shù)達到最大，為1.25×109CFU/g。因此，確定最佳培養(yǎng)時間為32 h。

圖5 培養(yǎng)時間對納豆菌活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of culture time on the viable count of Bacillus natto

2.6 培養(yǎng)溫度對納豆菌活菌數(shù)的影響

溫度對微生物的生長代謝有重要影響，其會影響菌體細胞內各種酶的活性及蛋白質等物質的合成[20]，進而影響菌體細胞的生長。

圖6 培養(yǎng)溫度對納豆菌活菌數(shù)的影響Fig.6 Effect of culture temperature on the viable count of Bacillus natto

由圖6可知，納豆菌活菌數(shù)隨著培養(yǎng)溫度的升高呈先增加后降低的趨勢，分析原因可能是溫度過低，納豆菌生長緩慢，溫度太高，菌體過早衰亡。當培養(yǎng)溫度為40 ℃時，最有利于納豆菌的生長，活菌數(shù)最高，達1.04×109CFU/g。因此，確定最佳培養(yǎng)溫度為40 ℃。

2.7 直投式納豆菌發(fā)酵劑發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果

對正交試驗所得數(shù)據進行分析處理，正交試驗結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

由表2可知，影響納豆菌活菌數(shù)的主次因素依次為接種量＞加水量＞培養(yǎng)時間＞培養(yǎng)溫度。由表3可知，接種量及加水量對納豆菌活菌數(shù)的影響極顯著（P＜0.01），培養(yǎng)時間對納豆菌活菌數(shù)的影響顯著（P＜0.05），培養(yǎng)溫度對納豆菌活菌數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。故由極差分析和方差分析結果可知，納豆菌生長的最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為A2B3C3D1，即接種量4.0%、加水量40%、培養(yǎng)溫度43 ℃、培養(yǎng)時間28 h。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，最終制得的直投式納豆菌發(fā)酵劑中納豆菌活菌數(shù)含量達4.71×109CFU/g，高于張雯等[21]采用噴霧干燥制備的納豆菌菌劑（6.5×108CFU/g），該直投式納豆菌發(fā)酵劑達到了市售發(fā)酵劑的標準要求[22]。因此，確定直投式納豆菌發(fā)酵劑的最佳培養(yǎng)條件為接種量4.0%、加水量40%、培養(yǎng)溫度43 ℃、培養(yǎng)時間28 h。

表2 直投式納豆菌發(fā)酵劑發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of directed vat set Bacillus natto starter culture

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

3 結論

本研究以添加1.5%蛋白胨的大米粉替代傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)納豆菌，通過單因素及正交試驗優(yōu)化納豆菌的培養(yǎng)條件，得出納豆菌的最佳培養(yǎng)條件為接種量4.0%、加水量40%、培養(yǎng)溫度43 ℃、培養(yǎng)時間28 h。在此優(yōu)化條件下，納豆菌生長良好，菌體量多，將培養(yǎng)物烘干后制成的直投式納豆菌發(fā)酵劑中的活菌數(shù)含量達4.71×109CFU/g。該納豆菌發(fā)酵劑達到了市售發(fā)酵劑的標準要求，采用此技術制備直投式納豆菌發(fā)酵劑可簡化生產過程，對設備要求低，成本低，因此市場前景廣闊。