昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因的克隆、表達及酶學性質研究

王一雯，馬 煥，權淑靜，陳國參，王佰濤，安明理，劉德海，王有科，解復紅

（1.河南省科學院 生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術研究中心，河南 鄭州 450008）

海藻糖（trehalose）是由兩分子葡萄糖以α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，廣泛存在于細菌、酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲、無脊椎動物等生物體體內[1-2]。海藻糖化學性質穩(wěn)定，具有非還原性、保濕性、熱酸穩(wěn)定性、抗凍結、干燥性等物化性質，對生物體及生物大分子有很好的非特異性保護作用，因此，海藻糖被廣泛應用于食品加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、生化制品業(yè)和化妝品產(chǎn)業(yè)中[3-5]。在食品工業(yè)中，海藻糖作為食品添加劑能夠防止淀粉老化、蛋白質變性和脂類物質的氧化變質；保持食品原有的色澤、風味；也可用于食品、水果、蔬菜的保鮮[6-9]。因此，海藻糖的市場需求量很大。

海藻糖在生物體內的合成途徑主要有3種[10]：6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）/6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）途徑，在自然界中分布最為廣泛，在真核生物、真細菌和古生菌中都有發(fā)現(xiàn)[11-12]；麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase，MTSase）/麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose trehalohydrolase，MTHase）途徑，主要存在于細菌和古生菌中[13-14]；海藻糖合酶（trehalose synthase，TreS）途徑[15-16]。與其他海藻糖合成途徑相比，TreS途徑具有一定的優(yōu)勢，只需要一種酶一步反應就能夠獲得海藻糖，而且其底物為更加廉價的麥芽糖。

目前，國內外研究者已從分支桿菌（Mycobacterium smegmatis）[17]、紅球菌（Rhodococcus opacus）[15]、嗜熱放線菌（Thermobifida fusca）[16]等不同的微生物中克隆、表達了海藻糖合酶基因，并研究了重組海藻糖合酶的性質[18-20]。同時，探究其蛋白結構及催化機理[21-23]。但由于海藻糖合酶催化雙向反應，不能完全將麥芽糖轉化成海藻糖，因此，尋找轉化率高的海藻糖合酶具有十分重要的意義。

本實驗室前期已從云南昆明磷礦粉中分離得到一株可以產(chǎn)生海藻糖的昆明假單胞菌（Pseudomonas kunmingensis）HL22-2[24]，本研究以其為研究對象，采用熱不對稱交錯聚合酶鏈式反應（thermal asymmetric interlaced-polymerase chain reaction，Tail-PCR）從該菌株中克隆海藻糖合酶基因HL22-2TreS，將該基因與表達載體pETM3C連接形成重組載體，在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pLysS中進行異源表達，通過Ni-NTA柱純化重組酶HL22-2TreS，并對其酶學性質進行分析，為工業(yè)利用其將廉價的麥芽糖轉化成附加值更高的海藻糖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質粒

昆明假單胞菌（Pseudomonas kunmingensis）HL22-2（CGMCC 1.12273，DSM 25974）：本實驗室分離保藏；Escherichia coliDH5α：寶生物工程（大連）有限公司；Escherichia coliBL21（DE3）pLysS：北京康為世紀生物科技有限公司；pGEM-T載體：美國Promega公司；pETM3C載體：美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶BamH I（10 U/μL）、Not I（20 U/μL）、T4脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶（5 U/μL）：美國ThermoFisherScientific公司；LATaq酶（5U/μL）、Genome Walking Kit：日本TaKaRa公司；質粒小量抽提試劑盒、DNA快速純化/回收試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術有限公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒：美國Axygen公司；麥芽糖和海藻糖（純度≥99%）：德國Merk公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）：上海百賽生物技術有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：英國Oxoid公司。

1.1.3 引物

本研究中所用的引物及其序列見表1，引物由軟件Primer Premier 5.0設計，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min。

優(yōu)化肉湯（superoptimalbroth，SOB）培養(yǎng)基：蛋白胨20g，酵母提取物5 g，NaCl 0.5 g，KCl 0.2 g，MgCl21 g，蒸餾水1 L，pH自然，121 ℃高壓下蒸汽滅菌20 min。

分解抑制型優(yōu)化肉湯（super optimal broth with catabolite repression，SOC）培養(yǎng)基：在SOB培養(yǎng)基中加入用0.22 μm濾膜過濾除菌后的1 mol/L葡萄糖20 mL，混勻，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

ST8R臺式高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；GF254硅膠板：青島海洋化工有限公司；T-Gradient&ThermoblockO型PCR擴增儀：德國Biometra公司；DYY-6C核酸電泳儀：北京六一儀器廠；Agilent1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司；JYD-650超聲細胞破碎儀：上海之信儀器有限公司；Ni-NTA柱：安諾倫（北京）生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因的克隆

采用Tail-PCR克隆菌株海藻糖合酶基因，具體方法如下：

（1）根據(jù)昆明假單胞菌的海藻糖合酶的兩段保守序列，設計引物TreS-MF/MR。采用細菌基因組提取試劑盒提取昆明假單胞菌HL22-2的基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系：LATaq（5 U/μL）聚合酶0.5 μL，基因組DNA模板0.5 μL，引物TreS-MF和TreS-MR各0.6 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）0.6 μL，10×buffer 3 μL，超純水24.2 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

（2）通過PCR擴增獲得一段DNA片段，測序。根據(jù)獲得的序列設計引物PU-1、PU-2、PU-3和PD-1、PD-2、PD-3，用Genome Walking Kit進行Tail-PCR，獲得DNA片段兩端的序列。

（3）根據(jù)序列分析，獲得昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因全長序列，設計引物TreS-F/R，以基因組DNA為模板，PCR擴增得到昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因HL22-2TreS。PCR擴增體系：LATaq聚合酶0.2 μL，基因組DNA模板0.5μL，引物TreS-F和TreS-R各0.6μL，dNTPs0.6μL，2×GC buffer 15 μL，超純水12.5 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

將PCR擴增產(chǎn)物純化，與載體pGEM-T連接，轉化至Escherichia coliDH5α感受態(tài)細胞中，挑選轉化子進行菌落PCR，挑取陽性轉化子進行測序，獲得昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因HL22-2TreS序列信息。采用SignalP4.1server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽序列，采用Clustal X 2.0對海藻糖合酶的氨基酸序列進行比對[25]。

1.3.2 昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因HL22-2TreS的表達

分別將純化的昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因HL22-2TreS、載體pETM3C用BamH I和Not I進行雙酶切，回收目的片段、T4 DNA連接酶連接，轉化至Escherichia coliDH5α感受態(tài)細胞中，挑選轉化子進行菌落PCR，挑取陽性轉化子進行測序。將正確的重組質粒轉化至Escherichia coliBL21（DE3）pLysS感受態(tài)細胞中，挑選轉化子進行菌落PCR，采用終濃度20%（V/V）的甘油保藏陽性轉化子。

種子培養(yǎng)：將陽性轉化子接入裝有5 mL LB培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素和34 μg/mL氯霉素）的20 mL試管中，于37 ℃、220 r/min條件下過夜培養(yǎng)。

誘導培養(yǎng)：將過夜培養(yǎng)好的菌株按1%（V/V）的接種量轉接到裝有100 mL LB培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素和34 μg/mL氯霉素）的250 mL三角瓶中，于37 ℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。待菌液OD600nm值為0.6時，將三角瓶置于冰上10 min左右，加入終濃度為300 nmol/L的IPTG，迅速將其轉至16 ℃、220 r/min條件下進行低溫誘導培養(yǎng)12 h，離心，收集菌體。將菌體重懸在20 mmol/L磷酸鈉緩沖液中（pH 7.4，含有終濃度500 mmol/L NaCl和20 mmol/L咪唑），超聲破碎細胞、離心，上清液即為粗酶液[26]。

1.3.3 昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶的純化

用20 mmoL/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4，含有終濃度500mmol/LNaCl和20mmol/L咪唑）平衡Ni-NTA柱，10mL粗酶液加入到平衡好的鎳柱，靜置1h，然后分別用含50mmol/L、90 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L咪唑的磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）分步洗脫，每一步的洗脫組分都測定酶活力，并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，最后將有酶活力的單一條帶的組分合并，即為純化的酶液[27]。采用Bradford法測定酶蛋白的濃度[28]。

1.3.4 海藻糖合酶活力的測定

在80 μL用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）配制的150 mmol/L的麥芽糖溶液中加入20 μL不同稀釋的酶液，混勻，37 ℃水浴30 min，100 ℃煮沸10 min。采用HPLC定量檢測海藻糖及麥芽糖的含量[18]。HPLC條件：色譜柱為ZORBAX NH2（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈∶去離子水=75∶25（V/V），檢測器為示差檢測器，流速為1.0 mL/min。采用不同濃度的標準海藻糖繪制標準曲線，然后根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品中海藻糖和麥芽糖的轉化率，進而得出海藻糖合酶活力。

海藻糖合酶酶活力定義：在37 ℃、pH 7.4條件下，每分鐘生成1 μmol海藻糖所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1.3.5 海藻糖合酶對底物的轉化

在80 μL用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）配制的150 mmol/L的麥芽糖溶液或海藻糖溶液中加入20 μL酶液，混勻，37 ℃水浴保溫30 min，100 ℃煮沸10 min。取反應液1 μL進行薄層層析（thin layer chromatography，TLC）[18]。層析板為TLC Silica gel 60 F254 20 cm×20 cm，層析液為n-正丁醇∶吡啶∶水（4∶6∶1，V/V）。

1.3.6 海藻糖合酶的酶學性質

最適反應溫度：在80 μL用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）配制的150 mmol/L的麥芽糖溶液中加入20 μL酶液，混勻，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下保溫30 min，然后將離心管在100 ℃煮沸10 min以終止反應，測定海藻糖合酶活力，并以最高酶活力為100%，計算相對酶活。溫度穩(wěn)定性：先分別將海藻糖合酶在20 ℃、30 ℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃條件下保溫30 min，然后在37 ℃條件下測定海藻糖合酶活性，并以最高酶活力為100%，計算相對酶活。

最適反應pH值：用不同pH值的緩沖液（甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH 2.0、pH 3.0），乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0、pH 5.0），磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0），甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.0、pH 10.0））溶解麥芽糖，在80 μL 150 mmoL/L的麥芽糖溶液中加入20 μL分別用不同pH值緩沖液稀釋的酶液，混勻，在37 ℃條件下測定海藻糖合酶活力。并以最高酶活力為100%，計算相對酶活。pH值穩(wěn)定性：分別將海藻糖合酶用不同pH的緩沖液稀釋，37 ℃保溫1 h，然后取20 μL處理后的酶液加入80 μL用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）配制的150 mmol/L的麥芽糖溶液中，混勻，在37 ℃條件下測定海藻糖合酶活力，并以最高酶活力為100%，計算相對酶活。

金屬離子對海藻糖合酶活力的影響：先將純化的3 U海藻糖合酶和用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）溶解的不同金屬離子（1 mmol/L和10 mmol/L）在37℃條件下保溫30 min，以未處理的藻糖合酶為對照，在37 ℃條件下檢測海藻糖合酶活力，并采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

Km值的測定：參照文獻[29]測定麥芽糖和海藻糖的Km值。

2 結果與分析

2.1 昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因HL22-2TreS的克隆和序列分析

以昆明假單胞菌HL22-2基因組DNA為模板，以TreSMF/MR為引物，克隆出一個堿基長度為654 bp的DNA片段，測序。根據(jù)獲得的序列設計引物PU-1、PU-2、PU-3和PD-1、PD-2、PD-3，采用Genome Walking Kit進行Tail-PCR，獲得DNA片段兩端的序列。根據(jù)序列分析，獲得昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因HL22-2TreS全長序列，設計引物TreS-F/R，以基因組DNA為模板，PCR擴增得到昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因HL22-2TreS，結果見圖1。

圖1 昆明假單胞菌HL22-2海藻糖合酶基因HL22-2TreSFig.1 Trehalose synthase gene HL22-2TreS of Pseudomonas kunmingensis HL22-2

由圖1可知，HL22-2TreS基因全長為3 336 bp（GenBank accession number：MF543128），編碼1 111個氨基酸，其翻譯的蛋白序列中不含信號肽，預測蛋白質分子質量為126 kDa。

將HL22-2TreS的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的海藻糖合酶序列進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，HL22-2TreS的氨基酸序列與假單胞菌（Pseudomonassp.）來源的海藻糖合酶的氨基酸序列高度相似（與來自于Pseudomonassp.K35的海藻糖合酶（GenBank：OCX97659.1）的氨基酸相似度達99%），但這些海藻糖合酶的氨基酸序列都是由基因組測序后通過基因注釋得出來的，對其功能并沒有加以驗證。將4個已成功表達并得到功能驗證的不同微生物來源的海藻糖合酶的氨基酸序列與HL22-2TreS編碼的氨基酸序列進行多重序列比對，結果見圖2。

由圖2可知，HL22-2TreS與4個不同微生物來源的海藻糖合酶的氨基端序列具有極高的相似度，而羧基端的相似度不高，說明HL22-2TreS確為海藻糖合酶家族成員。

圖2 HL22-2TreS與不同微生物來源的海藻糖合酶氨基酸序列同源性比對結果Fig.2 Results of homology comparison of amino acid sequences between Hl22-2TreS and trehalose synthase from different microorganisms

2.2 HL22-2TreS基因的表達和重組酶HL22-2TreS的純化

圖3 重組酶HL22-2TreS的SDS-PAGE結果Fig.3 Results of SDS-PAGE of recombinase HL22-2TreS

將昆明假單胞菌HL22-2菌株的海藻糖合酶基因HL22-2TreS連接到pETM3C質粒上，轉化到E.coliBL21（DE3）pLysS菌株中進行誘導表達。通過超聲破碎細胞，上清液中海藻糖合酶的比活力為12.8 U/mg，說明HL22-2TreS被成功表達。上清液通過Ni-NTA純化后，進行SDS-PAGE電泳分析，結果見圖3。

由圖3可知，經(jīng)過12 h誘導表達，菌體裂解液的主要蛋白為HL22-2TreS，經(jīng)Ni-NTA柱純化后，得到一個分子質量約為126 kDa的條帶，與理論分子質量的計算結果相一致，純化后海藻糖合酶的比活力為38.5 U/mg。

2.3 重組酶HL22-2TreS對不同底物的轉化能力

圖4 HL22-2TreS對不同底物轉化后產(chǎn)物的薄層層析結果Fig.4 Thin layer chromatography results of reaction products from different substrates by HL22-2TreS

由圖4可知，HL22-2TreS既能將麥芽糖轉化成海藻糖，又能將海藻糖轉化成麥芽糖。HPLC定量檢測海藻糖和麥芽糖的吸收峰，并通過標準曲線計算得出重組酶HL22-2TreS對麥芽糖和海藻糖的轉化率分別為73.2%和52.5%。

2.4 重組酶HL22-2TreS的酶學性質

2.4.1 溫度對重組酶HL22-2TreS活力的影響

圖5 重組酶HL22-TreS的最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.5 Optimum reaction temperature and temperature stability of recombinase HL22-2TreS

由圖5可知，當反應溫度為40 ℃時，重組酶HL22-2TreS的酶活力最高；當反應溫度＞70 ℃之后，酶活力基本消失。當重組酶HL22-2TreS在40 ℃以下保溫30 min后，酶活力比較穩(wěn)定，相對酶活力保持在90%以上，在50 ℃保溫30 min后，相對酶活力為67.8%，但是，當在高于60 ℃以上溫度保溫30 min之后，酶活力快速下降。結果表明，重組酶HL22-2TreS的最適反應溫度為40 ℃，在20～50 ℃條件下比較穩(wěn)定。

2.4.2 pH值對重組酶HL22-2TreS活力的影響

圖6 重組酶HL22-TreS的最適pH值及pH值穩(wěn)定性Fig.6 Optimum reaction pH and pH stability of recombinase HL22-2TreS

由圖6可知，重組酶HL22-2TreS的最適反應pH值為7.0，在pH 6.0～9.0比較穩(wěn)定。

2.4.3 金屬離子對重組酶HL22-2TreS活力的影響

表2 金屬離子對重組酶HL22-2TreS酶活力的影響Table 2 Effect of metal ions on the activity of recombinase HL22-2TreS

由表2可知，Cu2+、Hg2+、Ba2+及Al3+對海藻糖合酶的活力有強烈的抑制效果，其中Cu2+、Hg2+對酶活力完全抑制；Fe2+、Co2+對海藻糖合酶活力有部分抑制效果，隨著離子濃度的升高，Co2+對酶活力的抑制效果更加明顯，而Fe2+對酶活力的抑制效果減弱；其他金屬離子對酶的活力影響不明顯。

2.4.4 重組酶HL22-2TreS對麥芽糖和海藻糖的Km值

HL22-2TreS對麥芽糖和海藻糖的Km值分別為20.6mmol/L和87.5 mmol/L，說明HL22-2TreS對麥芽糖具有更高的親和性，更容易將麥芽糖轉化成海藻糖，使反應更容易朝著合成海藻糖的方向進行。

3 結論

通過Tail-PCR從云南昆明磷礦來源的昆明假單胞菌（Pseudomonas kunmingensis）HL22-2中克隆得到海藻糖合酶基因HL22-2TreS，其基因全長為3 336 bp，編碼1 111個氨基酸，氨基酸序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中相關的海藻糖合酶序列具有極高的相似性。將該基因與表達載體pETM3C連接后在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pLysS中進行異源表達，并通過Ni-NTA柱純化得到分子質量約126 kDa的海藻糖合酶HL22-2TreS，其最適反應溫度和pH值分別為40 ℃和7.0，在溫度20～50 ℃及pH值6.0～9.0條件下比較穩(wěn)定；Cu2+，Hg2+，Ba2+及Al3+對海藻糖合酶的活力有強烈的抑制效果。HL22-2TreS催化的反應是雙向進行的，其對麥芽糖和海藻糖的米氏常數(shù)（Km）分別為20.6 mmol/L和87.5 mmol/L，對麥芽糖具有更高的親和性，更容易將麥芽糖轉化成海藻糖。因此，利用昆明假單胞菌HL22-2的海藻糖合酶可將廉價的麥芽糖轉化成具有更高附加值的海藻糖，具有很高的工業(yè)應用潛力。