氣相色譜串聯質譜法測定白酒中的甲醇含量

張菁菁，劉笑笑，王小喬，吳福祥

（蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730000）

白酒是中國特有的一種蒸餾酒，在我國有上千年歷史[1-2]。白酒生產過程中會自然產生甲醇、乙醇和其他有機物質；由于甲醇和乙醇的沸點接近（分別在64.7 ℃和78.3 ℃），所以白酒中不可避免地含有一定量的甲醇[3]。甲醇是白酒中最主要的有害物質，對人體的毒作用是由甲醇本身及其代謝產物甲醛和甲酸引起的，主要侵害視神經，導致視網膜受損，視神經萎縮，視力減退和雙目失明[4-11]。

2012年以來，國內白酒行業先后陷入“酒精勾兌”、“塑化劑”、“基酒外購”、“添加劑”等風波中，年份白酒問題、散裝白酒中毒等質量安全事件接連發生，折射出我國白酒行業發展的諸多問題[12]。白酒造假主要在于摻加甲醇、雜醇油等物質[13]。有一些不法分子濫用工業酒精冒充食用酒精，用工業甲醇直接勾兌成“毒酒”，以牟取暴利，造成酒中甲醇含量遠遠高于國家規定的衛生標準[14]。而因飲用甲醇含量超標的白酒而造成的食物中毒事件仍時有發生。因此，建立白酒中甲醇含量的準確快速檢測方法很有必要。

目前，檢測酒類中甲醇的方法有比色法[15-19]、氣相色譜法[20-24]、高效液相色譜法[25]、近紅外光譜法[26]、激光拉曼光譜法[27]、Fourier變換紅外光譜法[28]等，國家標準中甲醇的檢測方法為氣相色譜法[29]，這些方法存在測前處理復雜，靈敏度有限，定性準確度有待提高、設備檢測成本高等問題。在國家標準GB 5009.266—2016《食品中甲醇的測定》中，對甲醇的檢測采用氫火焰離子化檢測器，由于白酒中揮發性成分復雜且沸點較低，在日常檢驗工作中發現，因保留時間相近，甲醇峰常受到乙酸乙酯、乙醇等沸點相似物質的干擾，造成基線不穩、峰重疊等情況的發生，故選擇氣相色譜質譜聯用儀法測定以消除干擾物質。

三重四極桿質譜檢測器能有效排除雜質干擾，提高檢測的靈敏度、準確度。因此本研究采用氣相色譜質譜技術，旨在建立三重四極桿多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測甲醇的方法，以期為白酒中甲醇的檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（99.8%）、叔戊醇（99.5%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH標準品有限責任公司；乙醇（色譜純）：德國Merck有限公司；實驗用水：Milli-Q超純水機制備。

樣品：青稞酒1批、醬香型白酒6批、濃香型白酒10批、清香型4批、其他香型6批。

1.2 儀器與設備

7000D-7890B氣質聯用儀：美國安捷倫科技有限公司；MSE125P-ICE-DU十萬分之一天平：瑞士梅特勒-托利多有限公司；移液器：德國艾本德儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制方法

甲醇標準溶液配制：準確稱取甲醇對照品0.111 36 g于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液（體積分數40%）定容制得11.11 mg/mL甲醇儲備液。為研究確定本方法分別在低濃度范圍和高濃度范圍的準確性和穩定性，故分別配制低濃度范圍（1號）和高濃度范圍（2號）的甲醇標準曲線。

1號甲醇標準曲線的配制：準確吸取甲醇標準溶液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用乙醇溶液（體積分數40%）定容制得11.11 μg/mL甲醇標準中間液，分別吸取不同含量的標準中間液，用乙醇溶液（體積分數40%）定容制得質量濃度為0、0.222 2 μg/mL、0.555 5 μg/mL、0.888 8 μg/mL、1.111 0 μg/mL、2.222 0 μg/mL、5.555 0 μg/mL、8.888 0 μg/mL、11.110 0 μg/mL的1號標準曲線。

2號甲醇標準曲線的配制：準確吸取甲醇標準溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液（體積分數40%）定容制得1.111 mg/mL甲醇標準中間液，分別吸取不同含量的標準中間液，用乙醇溶液（體積分數40%）定容制得質量濃度梯度為0、11.11μg/mL、22.22 μg/mL、44.44 μg/mL、66.66 μg/mL、88.88 μg/mL、111.10 μg/mL、166.60 μg/mL、222.20 μg/mL的2號標準曲線。

1.3.2 儀器檢測條件

氣相色譜條件：毛細管色譜柱Agilent DB-FFAP（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：40 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至130 ℃，再以30 ℃/min升至200 ℃；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：分流進樣；分流比：40∶1；柱流量：1.0 mL/min；進樣體積：1.0 μL。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；掃描類型：MRM動態反應監測；前級離子質核比（m/z）：32；產物離子質核比（m/z）：31。

1.3.3 樣品處理方法

為簡化處理方法，減少易揮發物質的損失，本方法直接吸取樣品1.5 mL于進樣小瓶中待測，采用外標法定量。

1.3.4 計算公式

白酒中甲醇含量計算（測定結果按100%酒精度折算）：

X：試樣中甲醇的含量，g/L；ρ：由標準曲線得出試樣中甲醇的質量濃度，mg/L；c：試樣的酒精度，%vol；100：按100%酒精度換算；1 000：單位換算系數。

1.3.5 數據處理

每次實驗重復操作3次，取平均值。應用SPSS20.0軟件和Excel進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 檢測模式的選擇

配制質量濃度為1.0 μg/mL的甲醇標準溶液，分別采用選擇離子監測（select ion monitoring，SIM）模式及多反應監測模式（MRM）測定，分析譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 單離子監測模式下甲醇溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of methanol solution in single ion monitoring mode

圖2 多反應監測模式下甲醇溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of methanol solution in multiple reaction monitoring mode

由圖1和圖2可以看出，在SIM模式條件下，2.6 min甲醇峰未檢出，由于溶劑乙醇含量較高、分子結構與甲醇近似、質核比相差較小，在氣相色譜圖中是相鄰的兩個峰，3.0 min的乙醇峰對甲醇檢測有較大的干擾；而在MRM模式母離子質核比32，碎片離子質核比31條件下，2.6 min甲醇峰響應值較高，且有效降低乙醇峰的響應值，降低了乙醇干擾。

2.2 定量方法的選擇

國家標準GB 5009.266—2016《食品中甲醇的測定》中定量方法選擇內標法[29]，內標物質為叔戊醇。本實驗室分別采用內標法和外標法分別對三個加標樣品和一個陽性樣品進行測定，結果見表1。由表1可知，內標法與外標法測定白酒中甲醇結果無顯著差異（P＞0.05）。

表1 定量方法對比結果Table 1 Comparison of quantitative methods

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍

圖3 1號（A）及2號（B）甲醇溶液標準曲線Fig.3 Standard curve of methanol solution No.1 (A) and No.2 (B)

分別配制兩套不同質量濃度范圍的甲醇標準溶液，按照上述條件測定，以質量濃度（μg/mL）對相應的峰面積進行線性回歸，得甲醇標準溶液的標準曲線（圖3）及檢測范圍、相關系數。由圖3可知，本方法測定甲醇在0.2～10 μg/mL、10～200 μg/mL范圍內線性均良好，相關系數R2均＞0.999，說明在低濃度范圍和高濃度范圍都能夠準確定量分析。

2.3.2 精密度試驗

分別在50 mL容量瓶中添加0.5 mL、5.0 mL 100 μg/mL的甲醇標準溶液，并用乙醇溶液（體積分數40%）定容，配制成質量濃度分別為1.0 μg/mL、10.0 μg/mL的標準溶液，兩個質量濃度分別進樣6次，計算精密度，結果見表3。實驗結果表明，各組的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均＜5%，重現性好，精密度能達到實驗要求。

表3 精密度試驗結果Table 3 Results of precision tests

2.3.3 檢出限試驗

將10 μg/mL甲醇標準使用液逐步稀釋，當稀釋至甲醇質量濃度為0.1 μg/mL時，峰高為基線噪聲的3倍，于是將0.1 μg/mL作為方法檢出限。與國家標準GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定方法》檢出限7.5 mg/mL相比，國標法檢出限為本方法檢出限的75倍，本方法顯著提高了檢測靈敏度。

2.3.4 回收率試驗

取一空白樣品，添加1 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL甲醇質量濃度水平的四組白酒做加標回收試驗，每組做6份平行，結果見表4。由表4可知，4組平均回收率分別為89.17%、92.28%、96.63%、98.52%，回收率試驗結果RSD在1.54%～2.39%之間，回收率較高且穩定，準確度符合測定要求。

表4 方法回收率試驗結果Table 4 Results of recovery rates tests of method

2.4 實際樣品的測定

采用優化的實驗條件對26個白酒樣品進行檢測，結果表明25批白酒樣品甲醇均小于國家標準GB 2757—2012《食品安全國家標準蒸餾酒及其配制酒》[30]中規定的限量值0.6 g/L，而疑似陽性樣品的檢測結果遠超過國家標準限量值0.6 g/L，其色譜圖見圖4。可見市場上仍存在個別白酒樣品甲醇含量超標的現象。

圖4 某白酒陽性樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of a Baijiu postive sample

3 結論

本研究建立了氣相色譜-質譜聯用法多反應監測模式測定白酒中的甲醇，選定的色譜質譜條件為：毛細管色譜柱Agilent DB-FFAP（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：分流進樣；分流比：40∶1；柱流量：1.0 mL/min；進樣體積：1.0 μL；電子電離源，離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；掃描類型：MRM動態反應監測；前級離子質核比（m/z）：32；產物離子質核比（m/z）：31。通過檢測條件優化和方法學驗證，該方法快速、簡便、準確，提高了甲醇測定的靈敏度和抗干擾能力，為白酒中甲醇檢測、白酒質量控制提供了新的方法。