一種異丙威膠體金免疫快速檢測試紙條的研制

馮月君，張 瑜，萬宇平，賈芳芳，李 靜，王喜平，王兆芹，何方洋

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；2.北京望爾生物技術有限公司，北京 102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京 102206）

異丙威又名滅撲散、葉嬋散，屬于氨基甲酸酯類農藥。1970年，異丙威被推薦用作殺蟲劑，觸殺作用較強，在防治水稻害蟲中發揮了重要作用。近年來，由于異丙威在農作物中的使用量不斷增加，導致了農藥殘留量較高，人體食用了農藥殘留較多的農作物，危害健康。

異丙威屬于速效性農藥，應用較為廣泛，然而快速檢測方法或文獻很少。目前，檢測異丙威藥物殘留的方法多為儀器方法[1]，主要有氣相色譜質譜法[2-5]、高效液相色譜法[6-11]、分散型固相萃取-氣相色譜法[12]、薄層掃描法[13]等，操作較復雜，成本較高，儀器方法較難應用于基層實驗室的大批量樣本檢測，目前尚未查閱到膠體金免疫層析法檢測異丙威的相關文獻，因此，本實驗采用快速檢測方法中的膠體金免疫層析法，研制一種異丙威膠體金免疫層析試紙條，以期建立能夠檢測蔬菜、水果中的異丙威農藥殘留的異丙威膠體金免疫快速檢測試紙條，具有實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異丙威標準品（純度≥95%）、甲草胺標準品（純度≥95%）、亞胺菌標準品（純度≥95%）、乙霉威標準品（純度≥95%）、異丁草胺標準品（純度≥95%）：北京標準物質研究中心；氯金酸（HAuCl4·3H2O）（分析純）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（分析純）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（分析純）：美國Sigma公司；檸檬酸三鈉（分析純）、碳酸鉀（分析純）、4-氨基-2-異丙基苯酚（分析純）、三乙胺（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、二氯甲烷（分析純）、正己烷（分析純）、吡啶（分析純）、石油醚（分析純）、三氟乙酸（分析純）、三氯甲烷（分析純）、硫酸鈉（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：北京中生百欣科技服務有限責任公司；蔬菜、水果：城北農貿市場；樣本提取劑（0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液）、樣本復溶液（0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液）：北京勤邦生物技術有限公司；8周齡小鼠：斯貝福（北京）生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GT-700膠體金分析儀：北京勤邦生物技術有限公司；MX-F渦旋儀、HFJ-10均質器：湖南湘立科學儀器有限公司；JA2003電子天平：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 異丙威半抗原的制備

取4-氨基-2-異丙基苯酚1.51 g，加二氯甲烷50 mL溶解，加二碳酸二叔丁酯2.18 g，三乙胺0.4 mL，室溫攪拌4 h，停止反應，旋蒸，除去有機溶劑，加水30 mL，乙酸乙酯40 mL×3萃取3次，合并有機相，蒸干，二氯甲烷∶正己烷（1∶7，V∶V）90 mL重結晶，得到化合物Ⅰ2.3 g，收率92%。

取化合物Ⅰ2.3 g，加無水丙酮60 mL溶解，0～5 ℃條件下，滴加異氰酸甲酯0.73 g，加吡啶1.2 mL，充分攪拌后，恢復至室溫，繼續攪拌3 h；旋蒸，除去有機溶劑，上硅膠柱，石油醚∶乙酸乙酯（5∶1，V∶V）洗脫分離，得到化合物Ⅱ2.7 g，收率96.43%。

取化合物Ⅱ2.7 g，加三氟乙酸40 mL溶解，室溫攪拌6 h后停止反應，旋蒸，除去溶劑，加三氯甲烷100 mL，溶解澄清，水洗三次，取有機相，無水硫酸鈉干燥后，蒸干，加乙酸乙酯：正己烷（1∶10，V∶V）120 mL進行重結晶，得到氨基異丙威半抗原產物1.4 g，收率77%。

異丙威半抗原的合成見圖1。

圖1 異丙威半抗原的合成Fig.1 Synthesis of isoprocarb hapten

1.3.2 免疫原的制備

取氨基異丙威半抗原50 mg，加1 moL/L鹽酸0.48 mL，加水5 mL，攪拌溶解，靜置5 min，0～5 ℃攪拌30 min，加亞硝酸鈉17.2 mg，繼續攪拌3 h，得到活化液A液；取BSA 500 mg，加0.1 moL/L氫氧化鈉溶液30 mL溶解，0～5 ℃攪拌30 min，得到B液，將全部的A液滴加到B液中，攪拌4 h。0.02 moL/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）透析3 d，每天換液3次，得到異丙威-BSA免疫原，-20 ℃保存備用[19]。

1.3.3 包被原的制備

取氨基異丙威半抗原30 mg，加1 moL/L鹽酸0.27 mL，加水5 mL，攪拌溶解，澄清，0～5 ℃攪拌30 min，加亞硝酸鈉13.1 mg，繼續攪拌3 h，得到活化液A液；取OVA 500 mg，加0.1 moL/L氫氧化鈉溶液30 mL溶解，0～5 ℃攪拌30 min，得到B液，將全部的A液滴加到B液中，攪拌4 h。在0.02 moL/L PBS緩沖液中透析3 d，3 h換一次緩沖液，每天換液3次，得到異丙威-OVA包被原，-20 ℃保存備用。

1.3.4 單克隆抗體的制備

將免疫抗原與弗氏完全佐劑體積比1∶1充分乳化，免疫8周齡BaLb/c小鼠，取免疫后的鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選獲得能穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。用體內誘生法[20]得到異丙威單克隆抗體溶液，-20 ℃保存。

1.3.5 膠體金的制備

取0.01%氯金酸水溶液100 mL加熱至沸騰；一邊攪拌，一邊準確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5 mL；待氯金酸水溶液變為酒紅色，繼續煮沸15 min，冷卻后，4 ℃避光保存。

1.3.6 異丙威單克隆抗體-膠體金標記物的制備

在磁力攪拌下，用0.2 moL/L Na2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至7.2，每毫升膠體金溶液中加入80 μg異丙威單克隆抗體，混勻，靜置10 min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的體積分數為1%，靜置10 min。離心、洗滌、重懸，4 ℃保存備用。

1.3.7 微孔試劑的制備

將100 μL異丙威單克隆抗體-膠體金標記物加入到微孔試劑微孔板中，置于冷凍干燥機，冷阱溫度為-50 ℃，預凍3 h，再真空干燥15 h，即得到異丙威單克隆抗體-膠體金標記物凍干的微孔試劑。

1.3.8 樣本中異丙威的檢測

前處理方法：擦掉白菜/蘋果樣品表面泥土，剪成1 cm左右見方的碎片；稱取樣品1 g至燒杯或提取瓶中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液，振蕩2 min；倒出樣品溶液，靜置3 min，將上清液倒入玻璃管中并進行編號，待檢。

向微孔中加入100 mL待檢樣本溶液，混勻，室溫下孵育3 min，吸取70 μL滴至試紙條上，反應10 min，根據圖2判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果。其他時間判讀無效。

圖2 試紙條結果判定示意圖Fig.2 Schematic diagram of strip result determination

1.3.9 方法學考察

（1）試紙條的最低檢出限

在空白蔬菜、水果樣本中分別添加異丙威標準品至質量濃度為0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L，按照1.3.8所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據實驗結果確定試紙條的最低檢出限（limit of detection，LOD）。

（2）試紙條的特異性

《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定：采用與待檢藥物同類藥物、類似物或可能聯合使用的藥物測定特異性，因此，本研究分別配制500 μg/L的甲草胺、亞胺菌、乙霉威和異丁草胺等藥物，用此試紙條檢測，重復3次，判斷試紙條的特異性。

（3）試紙條的準確性

總局辦公廳關于印發食品快速檢測方法評價技術規范的通知（食藥監辦科〔2017〕43號）：以假陽性率和假陰性率評價膠體金免疫層析法的準確性。取50份用儀器測定的空白蔬菜、水果樣品，用該試紙條檢測異丙威藥物殘留，計算假陽性率；取50份用儀器測定的添加異丙威質量濃度至10 μg/kg的陽性蔬菜、水果樣品，再用該試紙條檢測異丙威藥物殘留，計算假陰性率。《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定：試紙條假陽性率應＜5%，假陰性率應為零。

（4）試紙條的穩定性

將試紙條保存于2～8 ℃環境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續測定15個月。具體方法為：分別檢測20份空白蔬菜、水果樣品，添加異丙威質量濃度至10 μg/kg，重復測定2次，根據實驗結果判定試紙條的穩定性。

2 結果與分析

2.1 膠體金的鑒定

肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無雜質、透明度較高。取冷卻后的膠體金溶液在透射電鏡下觀察，結果見圖3。由圖3可知，膠體金顆粒的均一程度，測量金顆粒粒徑，經透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布比較均勻，金顆粒的粒徑為20 nm左右。

圖3 膠體金電鏡掃描結果（×100 000）Fig.3 Microscope scanning results of colloidal gold (×100 000)

2.2 試紙條的最低檢出限

制備異丙威質量濃度分別為0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L的蔬菜、水果樣品，按照1.3.8步驟進行檢測，確定試紙條的最低檢出限，結果見表1。由表1可知，0～8 μg/L檢測結果為陰性，10～14 μg/L的檢測結果為陽性，因此，該試紙條的最低檢出限為10 μg/kg。

表1 試紙條的檢出限Table 1 Detection limit of test strip

2.3 試紙條的特異性

按照1.3.9（2）步驟進行檢測，使用該試紙條檢測質量濃度為500 μg/L的甲草胺、亞胺菌、乙霉威和異丁草胺等藥物標準品溶液，結果見圖4。由圖4可知，檢測結果均呈陰性，表明該試紙條對以上藥物無交叉，特異性較好。

圖4 特異性試驗結果Fig.4 Results of specificity tests

2.4 試紙條的準確性

按照1.3.9節步驟進行檢測，部分檢測結果見圖5。

圖5 假陽性（A）及假陰性（B）試驗結果Fig.5 Results of false positive (A) and false negative (B) tests

由圖5A可知，用試紙條檢測50份空白蔬菜、水果樣品，檢測結果均為陰性，說明假陽性率＜5%；由圖5B可知，添加異丙威質量濃度為10 μg/kg的50份陽性蔬菜、水果樣品，試紙條檢測結果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求。

2.5 試紙條的穩定性

按照1.3.9節步驟進行檢測，其中白菜部分檢測結果見圖6。由圖6可知，12個月內，試紙條的假陽性率和假陰性率均符合要求，從第13個月起，試紙條會出現少量失效、假陰性等現象。因此，試紙條的穩定性良好。

圖6 穩定性試驗結果Fig.6 Results of stability tests

3 結論

本研究通過制備異丙威半抗原，讓其與載體蛋白偶聯得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，對試紙條進行了特異性、準確性、穩定性等性能測試，均符合要求。本試驗研制的試紙條最低檢出限為10 μg/kg，而且試紙條的檢測時間僅為15 min，比現有文獻中高效液相色譜法、氣相色譜等儀器方法靈敏度更高，用時更短，操作更簡便，儀器方法和薄層掃描法方法較為復雜，檢測時間至少為1 h以上，對于基層檢測單位來說，花費的時間成本和檢測成本均很高，因此本研究的快速檢測試紙條能夠有效解決這個問題，具有實際應用價值。