紫甘藍-葡萄汁復合乳飲品發酵工藝優化及其抗氧化性研究

丁欽然，陳亞楠，張嬌嬌，杜 鵬，宋 佳

（天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457）

紫甘藍（Brassica oleraceavar.capitata rubra），又名紫包菜，屬十字花科植物，在我國廣泛種植，是餐桌上的美食佳肴[1-2]。大量研究表明[3-5]，紫甘藍含有豐富的維生素和花青素（主要成分為矢車菊苷），具有明顯的抑菌和抗氧化功效[6-9]。同時具有抗炎、預防心血管疾病、保肝等多種生理功能[10]，廣泛用于食品、藥品、化妝品等領域。紫甘藍中半胱氨酸和優質蛋白對脂肪肝、酒精肝及肝臟功能障礙等疾病具有較好的防治效果[11]。

益生菌是一類定植于人體腸道、生殖系統內對宿主有益的微生物，可以產生對人體有益功效。目前，益生菌主要可分成乳桿菌類、雙歧桿菌屬、革蘭陽性球菌等[12]。研究表明，益生菌能夠提高機體的抗氧化能力，具有良好的降血脂功效，對緩解和治療腸易激綜合癥以及改善腸道微生物菌群有積極作用[13-14]。

酸乳在乳制品中占主導地位，目前，發酵酸乳已成為乳制品發展趨勢之一，除營養成分便于人體吸收，還具有一定的助消化、抗氧化、抗菌、增強免疫力的功能作用。目前，為滿足消費者對口感的需求，市場上不斷涌現不同水果口味的酸乳，但鮮見添加蔬菜的乳制品。本實驗以干燥、研磨等處理后的紫甘藍粉和脫脂牛乳為原料，接種德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）進行益生菌發酵，利用單因素試驗以及Box-Behnken試驗優化發酵條件確定最佳接種量、發酵溫度和時間，最后與新鮮葡萄汁復配，進而改善復合酸乳的口感、色澤等，制成一款風味口感較佳的新型乳制品。此外，測定分析紫甘藍復合酸乳的多酚含量及其抗氧化性，并對產品感官、理化及微生物指標進行測定。將紫甘藍與牛乳結合進行乳酸發酵，不僅可為人們日常生活增加一種風味可口的乳制品，而且為紫甘藍乳制品的相關研究與工業化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

紫甘藍、玫瑰香葡萄（糖含量15.2%～16.4%；酸含量0.48%～0.56%）、脫脂牛乳（蛋白質4%～6%；碳水化合物1%～2%）、蔗糖（食品級）：市售；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）CICC 20253，中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 化學試劑

MRS培養基：北京博星生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；酚酞：沈陽思諾達生物科技有限公司；沒食子酸（分析純）：成都埃法科技有限公司；福林酚（分析純）：上海源葉生物有限公司；碳酸鈉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；維生素C（vitamin C，VC）（分析純）：南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JYL-C010打漿機：九陽股份有限公司；LQ-A30002電子天平：瑞安市樂祺貿易有限公司；DHP-927電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；TG16B型高速臺式離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：北京天林恒泰科技有限公司；LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；JA1003A電子天平：上海精天電子儀器廠；BHS-1型數顯恒溫水浴鍋：福州泰美試驗儀器有限公司；PSSJ-4V型精密pH計：上海精密科學儀器公司；WFJ粉碎機：常州市磐豐干燥設備有限公司；FD-1A-50型真空冷凍干燥機：江蘇天翎儀器有限公司；MB-580型全自動酶標分析儀：濟南歐萊博科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料加工工藝流程及操作要點

操作要點：

（1）原料預處理

紫甘藍粉的制備：選用成熟度適中、表皮無機械損傷的紫甘藍，因其具有較大蔬菜氣味，清洗后切分塊狀，利用真空冷凍干燥機干燥處理（-80 ℃處理4～6 h），在保證其營養成分、抗氧化花青素等成分的結構和活性不被破壞的同時，很大程度上去除了蔬菜的生苦氣味，干燥后利用粉碎機將紫甘藍粉碎成粉，然后過40目篩后備用。

新鮮葡萄汁的制備：選用表皮與果肉色澤良好、成熟度適中、甜度較高的玫瑰香葡萄，洗凈后去皮和去籽處理，然后用榨汁機榨汁后通過65～70 ℃、20～30 min巴氏滅菌對其處理，處理后4 ℃保存備用。

（2）原料的混合

以紫甘藍粉與牛乳以1∶100（g∶mL）的比例混合均勻后，加入質量分數為8%～10%蔗糖，通過70 ℃、30 min巴氏滅菌，并冷卻至40 ℃。

（3）發酵

以德氏乳桿菌保加利亞亞種菌為發酵菌劑，取-80 ℃凍存的乳桿菌，以1%的接種量接入10 mL的MRS液體培養基中，于37 ℃搖床培養箱中以220 r/min培養13 h進行活化，活化后按接種量為5%接種到紫甘藍牛乳混合液中，在發酵溫度為30 ℃的條件下發酵至總酸含量保持不變時，終止發酵。

（4）調配、均質

發酵酸乳在無菌環境下加入已滅菌的新鮮葡萄汁后均質（230 MPa、55 ℃），制得一款淡藍色、口感細膩、風味獨特的紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料。

1.3.2 發酵工藝條件優化單因素試驗

為使產品口感更加柔和，風味更加豐富，對其發酵條件進行優化。以發酵酸乳總酸度為評價指標，分別考察發酵過程中接種量、發酵溫度和發酵時間等因素對酸度的影響。考察德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發酵溫度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、發酵時間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）對發酵酸乳總酸度的影響。

1.3.3 發酵工藝條件優化響應面試驗

根據單因素試驗結果，選擇接種量（U1）、發酵溫度（U2）、發酵時間（U3）為影響因素，以發酵酸乳總酸度（Y）為評價指標[15]，設計3因素3水平響應面試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization

1.3.4 酸乳調配工藝優化

本實驗以經過脫味處理的紫甘藍作為發酵原料，發酵后，在帶有蔬菜清香味的同時，微微帶有蔬菜的生苦味道。在保證酸乳的安全性、營養豐富的原則上，實驗利用新鮮葡萄汁作為調味劑。在響應面實驗結果最優樣本中，分別按添加量為15%、20%、25%、30%、35%的新鮮葡萄汁進行調配、均質，以感官評價為評價標準對紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料進行綜合評價。

1.3.5 紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料多酚含量測定

沒食子酸標準曲線的繪制[16]：精確吸取質量濃度為100 μg/mL沒食子酸標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.6 mL，加入0.8 mL福林酚試劑，避光反應3～5 min后加入10%碳酸鈉1.5 mL終止反應，加水定容至10 mL，避光反應2 h，于波長765 nm處測定吸光度值，以沒食子酸質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，標準曲線回歸方程為y=0.015x+0.039，相關系數R2為0.999 5。按照沒食子酸標準曲線回歸方程計算紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料樣品中多酚含量，結果以mg沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）/mL計。

1.3.6 紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料抗氧化活性分析

（1）鐵離子還原力[17]

維生素C標準曲線的繪制：將1 mg/mL VC標準溶液稀釋成0、5 mg/100 mL、10 mg/100 mL、15 mg/100 mL、20 mg/100mL、25mg/100mL，在96孔板的每個檢測孔中加入180μL鐵離子還原力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）工作液后加入5 μL各質量濃度標準液，混勻后37 ℃孵育3 min，于波長593 nm處測定吸光度值。用VC溶液為標準對照，測定不同質量濃度VC反應所得吸光度值，以VC質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y=1.054 4x+0.132（相關系數R2=0.999 6）。樣品FRAP用VC抗氧化當量VCEAC表示。FRAP值越大，表明其抗氧化性能力越強。

（2）DPPH自由基清除率的測定[18]

取1 mL復合酸乳與1 mL 0.1 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液混合反應20 min后，500 r/min 離心10 min，測定上清液在517 nm處的吸光度值記為Ai，同時用乙醇作空白對照，吸光度值記為Ac，以及1 mL樣品水溶液和1 mL無水乙醇混勻按上述方法測定吸光值記為Aj。DPPH自由基清除率計算公式如下：

1.3.7 產品品質分析

（1）感官評定[19]

選固定的15 位有經驗的評價人組成評審小組，從色澤、組織狀態、氣味、滋味和對發酵乳進行綜合評分，滿分100分，對15 組數據求平均值并進行統計分析。感官評分標準見表2。

表2 紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of purple cabbage-grape juice compound milk beverage

（2）理化指標

脂肪測定依據GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中堿水解法；非脂乳固體含量測定依據GB 5413.39—2010《食品安全國家標準乳和乳制品中非脂乳固體的測定》；蛋白質測定按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法；酸度測定按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》中酚酞指示劑法。鉛、鉻、汞、砷等重金屬含量依據GB 2762—2017《食品中污染物限量》測定。

（3）微生物測定

乳酸菌數測定按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》；大腸桿菌按照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》中平板計數法；致病菌如金黃色葡萄球菌檢驗按照GB 4789.10—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》；沙門氏菌測定按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝條件優化單因素試驗結果

2.1.1 接種量對紫甘藍發酵乳飲料酸度的影響

在37 ℃發酵18 h條件下，接種量設置為1%、2%、3%、4%、5%，測定各組酸度，結果見圖1。由圖1可知，隨著菌株接種量在1%～5%范圍內的增高，紫甘藍發酵乳飲料的酸度先逐漸增加；菌株接種量＞4%后酸度平緩。因此，最適接種量為4%。

圖1 接種量對紫甘藍發酵乳飲料酸度的影響Fig.1 Effect of inoculum on acidity of fermented milk beverage of purple cabbage

2.1.2 發酵溫度對紫甘藍發酵乳飲料酸度的影響

在接種量為3%，發酵時間為18 h條件下，發酵溫度對紫甘藍發酵乳飲料酸度的影響，見圖2。由圖2可知，當發酵溫度在33～37 ℃之間時，隨發酵溫度升高，乳飲料的酸度明顯增大，其原因可能是在溫度未達到最適溫度時，隨發酵溫度的增大，較高溫度更適宜菌的生長，提高菌的產酸能力；當發酵溫度為37 ℃時，發酵后乳飲料酸度最大，為96°T；當發酵溫度超過37 ℃時，發酵后乳飲料酸度降低，推測主要原因是溫度升高，超過了菌的最適溫度范圍值，菌的活性下降，產酸等物質的能力下降，降低了發酵后酸乳的風味口感。因此，最適發酵溫度為37 ℃。

圖2 發酵溫度對紫甘藍發酵乳飲料酸度的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on acidity of fermented milk beverage of purple cabbage

2.1.3 發酵時間對紫甘藍發酵乳飲料酸度的影響

在接種量為3%，發酵溫度為37 ℃條件下，酸度隨發酵時間變化結果見圖3。由圖3可知，發酵后乳飲料的酸度隨發酵時間在6～12 h范圍內的增長而增大，且在發酵12 h后，酸度趨于平緩，推測菌株發酵12 h，適宜菌株生長的營養物質基本耗盡，產酸能力微弱。因此，最適發酵時間為12 h。

圖3 發酵時間對紫甘藍發酵乳飲料酸度的影響Fig.3 Effect of fermentation time on acidity of fermented milk beverage of purple cabbage

2.2 發酵工藝條件優化響應面試驗結果

采用Design-Expert 8.0.6軟件設計Box-Behnken 試驗，進一步以紫甘藍發酵乳飲料的酸度（Y）為響應值，優化接種量（U1）、發酵溫度（U2）及發酵時間（U3），獲得最佳發酵條件。Box-Behnken 試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

采用Design-Expert 8.0.6對表3試驗結果進行回歸分析，得到的多元二次回歸方程如下所示：

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性由F檢驗來判定，P值越小，則相應變量的顯著程度越高[20]。由表4可知，模型的P值=0.000 2＜0.01，差異極顯著，具有統計學意義，失擬項P值=0.441 7，差異不顯著，說明所選模型與試驗擬合度較好，可用該模型對試驗結果進行分析。一次項U1、U2、U3、交互項U1U3、二次項U22、U32對響應值的影響極顯著（P＜0.01）。試驗因子對響應值不是簡單的線性關系，二次項和交互項與響應值都有很大的關系，說明方程的擬合是充分的，回歸方程也是高度顯著的，同時失擬項也進一步表明回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，因此可以利用該回歸方程確定最佳發酵工藝參數，接種量為5%、發酵溫度為38.5 ℃、發酵時間11.9 h的條件下，酸度預測值可達105.5 °T。為方便實際操作，將最佳發酵工藝參數修正為：接種量5%、發酵溫度39 ℃、發酵時間12 h，并在此條件下進行3次平行發酵試驗，酸度實際值可達（104.8±0.3）°T，與預測值無顯著性差異（P＞0.05）。

各因素交互作用對酸度影響的響應面及等高線見圖4。由圖4可知，當發酵溫度一定時，隨著接種量的增加，發酵乳飲料酸度值增大，但酸度值增大的幅度逐漸趨于平緩；當接種量一定時，隨著發酵時間的延長，發酵乳飲料酸度值增大趨于平穩后，略有降低趨勢；當發酵時間一定時，隨著發酵溫度的升高，發酵乳飲料酸度值先增大后減小，可表明發酵溫度、接種量和發酵時間三個因素兩兩之間交互作用顯著。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

圖4 接種量、發酵溫度與發酵時間交互作用對紫甘藍發酵乳飲料酸度影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots of effects of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on acidity of fermented milk beverage of purple cabbage

2.3 紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料感官評價結果

對響應面試驗結果中最優樣本加入不同比例葡萄汁調配后進行感官評分，結果如圖5所示。由圖5可知，在新鮮葡萄汁添加量15%～25%時，隨葡萄汁添加量增加，紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料的感官評分增高，主要原因為葡萄汁具有水果清香，可掩蓋紫甘藍蔬菜的生苦氣味，同時，葡萄汁富含較高比例的碳水化合物，與酸乳搭配可以提高酸乳的風味和滋味；在新鮮葡萄汁添加量為25%時，紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料的感官評分最高，為92分；在新鮮葡萄汁添加量＞25%之后，感官評分結果明顯降低，主要原因是葡萄汁中的碳水化合物掩蓋住酸乳的酸度，大大降低了口感。因此，葡萄汁的最適添加量為25%。

圖5 葡萄汁添加量對紫甘藍-葡萄汁乳飲料感官評分的影響Fig.5 Effect of grape juice addition on sensory evaluation of purple cabbage-grape juice compound milk beverage

2.4 紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料多酚含量及抗氧化能力分析

依據1.3.5方法測定紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料的多酚含量，并利用FRAP法和DPPH自由基清除法測定抗氧化能力，結果見表5。由表5可知，復合乳飲料中總多酚含量為（2.41±0.05）mgGAE/mL，FRAP值為（170.25±3.21）mgVCE/L，DPPH自由基清除率為（75.2±1.0）%。結果表明，紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料具有較好的抗氧化能力。

表5 紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料多酚含量和抗氧化能力測定結果Table 5 Results of polyphenol contents and antioxidant activity of purple cabbage-grape juice compound milk drink

2.5 紫甘藍-葡萄汁復合乳飲料質量分析

2.5.1 感官評價

產品呈現紫甘藍特有的淡紫色，質地細膩，口感順滑，酸甜適中，無乳清析出，酸奶的芳香與葡萄和甘藍的清香味結合呈現特殊的風味，無異味。

2.5.2 理化指標

非脂乳固體（8.1±0.3）g/100g；蛋白質（4.8±0.5）g/100 g；酸度（82.14±0.5）°T；鉛≤0.05 mg/kg；鉻≤0.3 mg/kg；總汞≤0.01 mg/kg；總砷≤0.1 mg/kg。均符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》和GB 2762—2017《食品中污染物限量》要求。

2.5.3 微生物指標

乳酸菌數≥1×106CFU/mL；大腸桿菌數≤1CFU/100mL；致病菌未檢出，均符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》要求。

3 結論

利用德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株作為發酵劑，以紫甘藍、脫脂牛乳作為混合發酵原料，通過單因素試驗以及響應面試驗設計確定了最佳發酵工藝：每100 mL牛乳中加入1%紫甘藍粉，接種量為5%、發酵溫度為39 ℃、發酵時間12 h；調配工藝：加入25%新鮮葡萄汁，此時發酵調配后的酸乳的酸度值為（82.14±0.5）°T，綜合感官評價分值達到92分；其多酚含量為（2.41±0.05）mgGAE/mL，FRAP值及DPPH自由基清除率分別為（170.25±3.21）mgVCE/L、（75.2±1.0）%。最終得到一款呈紫色、質地均勻，口感細膩、爽口，具有蔬菜和水果特有的清香且具有較高抗氧化性得產品。