超聲改性大豆親脂蛋白-羥丙基甲基纖維素乳液的凍融穩定性

鐘明明，廖 一，齊寶坤,2,3，方 琳，孫禹凡，謝鳳英,2,，李 楊,2,3,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱市食品產業研究院，黑龍江 哈爾濱 150000；3.東北農業大學 國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150000）

乳液是兩種不混溶液體的混合物，而蛋白乳液是一種非均多相分散體系，其不穩定性極大地影響食品的品質和感官特性[1]。長期以來，一直認為大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）由兩種主要的儲存蛋白組成，即大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S），然而，大豆儲存蛋白組分中大豆親脂蛋白質（soybean lipoprotein，SLP）含量占SPI儲存蛋白的30%左右，并有望作為天然乳化劑在食品工業中得到廣泛應用。羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methylcellulose，HPMC）是一種可食用性纖維素，其資源豐富、健康無毒，且具有良好的水溶性、成膜性和較強的表面活性，可以控制表面壓力并改善薄膜黏彈性[2]，作為良好穩定劑用于乳液制備。

食品加工過程中乳液通常會經歷反復的凍融循環，在冷凍-解凍的過程中會發生多種物理化學變化[3-4]，包括脂肪結晶、水分凍結、乳液冷凍濃縮、界面相變和生物大分子構象改變等，從而影響了乳液的穩定性[5]。目前，許多研究者利用物理、化學和酶法等改變蛋白質的空間結構和分子特性，從而改善蛋白乳液的凍融穩定性。丁儉等[6]研究超聲處理后的SPI與多糖協同穩定乳液的特性，并對所形成乳液在冷凍-解凍過程中失穩機理進行分析研究；Cisneros Estevez等[7]研究發現乳液的界面組成、加工條件等對乳液形成機制及凍融穩定性有一定影響；王喜波等[8]利用胰蛋白酶處理得到不同水解度的SPI水解物，隨后與葡聚糖發生美拉德反應，進一步研究其對乳液凍融穩定性的影響。綜上所述，目前關于乳化劑對純油體系結晶和乳液加工方式對乳液凍融穩定性影響的研究較多，但對改性SLP與HPMC形成的乳化體系中的乳液穩定機理與乳液結構特性構效關系的研究相對較少。

本實驗以不同超聲功率處理的SLP作為乳化劑，HPMC作為分散劑制備乳液，研究超聲改變蛋白質結構及其與纖維素交互作用對乳液凍融穩定性的影響，通過凍融前后乳液粒徑、ζ電位和微觀結構改變，對比分析乳液乳化性、聚結程度、出油率和濁度的差異，揭示乳液在冷凍-解凍過程中的失穩機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘東農42’大豆 東北農業大學大豆研究所；HPMC（I型，黏度30 mPa·s）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市東麗區天大化學試劑廠；葵花籽油市售；氯化鈉 天津市光復精細化工研究所；硫酸北京新光化工試劑廠；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KF-250W超聲波細胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；ULTRA-TURRAX UTL2000高壓均質機 上海標本模型有限公司；巨霸SC-15AH冷凍干燥機 上海卓易隆有限公司；LGR20-W臺式高速冷凍離心機 北京京立離心機有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；DELTAVISIONTMOMX SR激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司；UV-5100型高性能紫外-可見分光光度計 上海奧析科學儀器廠；JASCO-J815圓二色性分光光度計 日本Sanwa儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 SLP的提取

SLP的分離參考Samoto等[9]的方法并作修改。大豆磨粉，過60 目篩，正己烷脫脂制備低變性大豆脫脂粉，70 ℃干熱處理2 h，此時氮溶指數降至75%。稱取50 g干熱處理后的脫脂豆粉加入400 mL蒸餾水，用NaOH調節pH值至8.0，在20 ℃下攪抖1 h后3 000×g離心10 min，收集上清液并加入10 mmol/L Na2SO3，然后用H2SO4調節pH值至5.8，3 000×g離心10 min，用H2SO4調節上清液pH值至5.0，并在55 ℃下攪抖15 min，然后加入50 mmol/L NaCl溶液并用NaOH調節pH值至5.5，3 000×g離心10 min，沉淀即為SLP。

1.3.2 SLP超聲處理

將一定量SLP溶解在10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，配制質量濃度為1 g/100 mL的SLP溶液，將SLP溶液在不同超聲功率（0、200、300、400、500 W）下處理5 min，處理完成后在室溫下攪抖2 h備用。

1.3.3 SLP-HPMC乳液的制備

將不同超聲功率處理的SLP溶液（1 g/100 mL）加入到等量HPMC溶液（0.2 g/100 mL）中，邊滴加邊磁力攪抖，形成復合物后，攪抖30 min，再加入5 g/100 mL葵花籽油，先于1 000 r/min條件下粗均質3 min，再在100 MPa下高壓均質，制得不同超聲功率處理的SLP-HPMC乳液，記為SLP（0/200/300/400/500）-HPMC，4 ℃條件下貯藏備用[10]。

1.3.4 循環凍融處理

將不同超聲功率處理的SLP-HPMC乳液立即轉移到50 mL的具塞塑料管中，在-20 ℃冷凍貯存22 h后，在室溫下解凍2 h，取部分樣品進行后續分析。按上述步驟循環操作2 次。

1.3.5 粒徑和ζ電位分析

用10 mmol/L pH 7.4 PBS將各SLP-HPMC乳液稀釋至0.1 g/100 mL，裝入比色杯（PCS8501），使用激光粒度儀測定乳液粒徑分布和ζ電位。SLP（分散相）折射率為1.450，10 mmol/L pH 7.4 PBS（連續相）折射率為1.331[11]。實驗均在25 ℃下進行。

1.3.6 乳化活性和乳化穩定性測定

參考Li Chen等[12]的方法測定乳化活性指數（emulsification activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsification stability index，ESI）。乳液制備完成后，分別于0、10 min從底部取樣50 μL，經十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）稀釋200 倍，充分混合后在500 nm波長處測定吸光度，以SDS作空白對照。EAI和ESI分別按式（1）、（2）計算。

式中：ρ為SLP-HPMC乳液形成前的SLP質量濃度5 mg/mL；L為比色杯厚度1 cm；φ為葵花籽油體積分數0.25%；n為稀釋倍數200；常數T＝2.303；A0、A10分別為0、10 min時乳液的吸光度；Δt為10 min。

1.3.7 乳液微觀結構觀察

參考Hayashi等[13]的方法采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察乳液微觀結構，評價乳液的凍融穩定性。分別取1 mL新制和經過循環凍融處理的不同超聲功率處理乳液，加入40 μL尼羅紅混合均勻，染色30 min，取一滴染色后的乳液樣品于帶凹槽的載玻片上，蓋上蓋玻片，甘油密封。在488 nm激發波長處進行激光共聚焦掃描，油鏡觀察。采集圖像分辨率為1 024×1 024。實驗需避免玻片上污染物對圖像的影響。

1.3.8 濁度測定

將SLP-HPMC乳液用PBS溶液稀釋40 倍，以PBS為空白對照，用紫外-分光光度計于600 nm波長處測定吸光度，濁度按式（3）計算。

式中：n為稀釋倍數40；I為光程0.01 m。

1.3.9 聚結程度測定

聚結是乳液中油滴分子之間經過接觸合并形成大油滴的過程。利用激光粒度儀測定粒徑，聚結度按式（4）計算。

式中：D[4,3]f為凍融后乳液的體積平均粒徑/nm；D[4,3]i為初始乳液的體積平均粒徑/nm。

1.3.10 出油率的測定

參考Palanuwech等[14]的方法并略加改動。稱取0.015 g蘇丹Ⅲ試劑加入到1 000 g大豆油中，室溫攪抖12 h得到蘇丹Ⅲ油溶液。準確稱取4 g蘇丹Ⅲ油溶液和16 g待測乳液于50 mL離心管中，振蕩混勻后16 000×g、4 ℃離心20 min，收集上層油液于508 nm波長處測定吸光度，同時以大豆油作空白。出油率按式（5）計算。

式中：m0為蘇丹Ⅲ油溶液質量/g；m1為乳液質量/g；A為離心前后蘇丹Ⅲ油溶液吸光度的比值；ω為乳液中油相的質量分數/%。

1.3.11 圓二色光譜分析

參考Itoh等[15]的方法并做改動。使用圓二色光譜儀在190～260 nm、298 K范圍內對不同超聲功率處理的SLP溶液進行掃描，參數設定：路徑長度1mm；掃描速率100 nm/min；光譜分辨率0.1 nm；響應時間1 s；步長1 nm。通過CDPro軟件包計算SLP二級結構相對含量。

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0軟件進行處理，采用方差分析對數據進行差異顯著性分析（P＜0.05）。所有實驗均重復3 次，結果取平均值或平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 循環凍融對超聲改性SLP-HPMC乳液粒徑和ζ電位的影響

圖 1 循環凍融前后超聲改性SLP-HPMC乳液平均粒徑（A）和ζ電位（B）Fig. 1 Average particle size (A) and ζ potential (B) of sonicated SLP-HPMC emulsion before and after freeze-thaw cycles

通常蛋白乳液液滴的平均粒徑越小，乳液越穩定[16]。由圖1A可知，在凍融循環前不同功率超聲改性SLP-HPMC乳液平均粒徑均接近600 nm，經過1 次凍融循環后各乳液平均粒徑均增加1 倍以上，超聲功率為400 W時SLP-HPMC乳液平均粒徑最小，為（1 250.0±23.2）nm。經過2 次凍融后，SLP（0）-HPMC乳液的平均粒徑大幅增大，不同功率超聲改性SLP-HPMC乳液平均粒徑也不同程度地有所增加，其中超聲功率400 W時增幅最小，說明此時乳液相對穩定。

乳液表面電荷密度能有效反映乳滴之間的靜電相互作用。由圖1B可知，在pH 7.4 PBS中SLP（0）-HPMC乳液原始ζ電位為-11.29 mV，隨著超聲功率的增加，ζ電位絕對值呈先升高后降低趨勢。經循環凍融后所有乳液的ζ電位絕對值均有所下降。SLP（400）-HPMC乳液原始ζ電位為-17 mV，表面電荷密度最大，結合乳液的粒徑分布和微觀結構分析結果，表明超聲功率為400 W時乳液的凍融穩定性最好。經過2 次凍融后，乳液表面電荷進一步降低，這是由于不同功率超聲處理使蛋白的柔性區域和二級結構構象發生改變[17]，蛋白質結構構象變化影響其與多糖分子的結合，造成乳液表面所帶電荷的不同。此外，加入的多糖（HPMC）可以吸附到蛋白層形成界面絡合物，有效地避免界面復合物降解，從而增強乳液的穩定性[18]。Thanasukarn等[19]研究認為，在凍融處理過程中乳液蛋白分子會從油滴表面解吸出來，降低蛋白的乳化效率，同時表面電荷的減少導致乳液冷凍處理后油滴之間斥力減弱發生聚結。

2.2 循環凍融對超聲改性SLP-HPMC乳液ESI和EAI的影響

圖 2 凍融循環前后超聲改性SLP-HPMC乳液ESI（A）和EAI（B）Fig. 2 ESI (A) and EAI (B) of sonicated SLP-HPMC emulsion before and after freeze-thaw cycles

乳化特性是衡量蛋白吸附至油-水界面能力的指標，包括EAI和ESI[19]。EAI表示蛋白穩定的油-水界面層上其所占據的單位質量，ESI用于衡量乳液抵抗混亂的能力[20]。由圖2可知，與SLP（0）-HPMC乳液相比，經0～400 W超聲處理后，乳液EAI與ESI均增大，這可能是由于超聲處理增強了SLP的溶解性，超聲處理后SLP結構打開，溶解性增大的同時疏水基團暴露，使其與HPMC之間相互作用加強[21]。此外，吸附至油-水界面上的SLP與HPMC形成了雙分子層保護屏障，阻止了脂肪液滴的絮凝和聚沉[22]。

經凍融循環后EAI出現明顯降低，SLP（400）-HPMC乳液經兩次凍融循環后，其EAI由580.35 m2/g降低至86.55 m2/g。這可能是由于凍融過程破壞了SLP和HPMC之間的作用力，影響了SLP-HPMC構建的雙分子層導致乳液EAI急劇下降。乳液經凍融后ESI變化無明顯規律，SLP（400）-HPMC和SLP（500）-HPMC乳液在第1次凍融處理后ESI明顯升高，但經過第2次凍融又明顯降低，說明經過1 次凍融循環部分乳液能保持相對較好的穩定性，而經過2 次凍融循環后乳液會出現不同程度的分層現象。

2.3 超聲改性SLP-HPMC乳液的激光共聚焦顯微鏡觀察結果

由圖3可知，激光共聚焦掃描顯微鏡圖像中呈紅色熒光的核心和呈綠色熒光的外圍邊界[23-24]證明界面層有SLP-HPMC復合體系存在。未經凍融循環時，SLP（0）-HPMC乳液的粒徑最大，乳液的穩定性較差。SLP經超聲處理后，SLP（200）-HPMC乳液粒徑分布較均勻，但粒徑較大，而SLP（300）-HPMC和SLP（500）-HPMC乳液出現明顯的聚集現象，僅SLP（400）-HPMC乳液分散均勻且粒徑較小，乳液最穩定。經1 次凍融循環后，SLP（0）-HPMC乳液的凍融穩定性最差，出現明顯的水-油分離現象，同樣，SLP（200）-HPMC和SLP（300）-HPMC乳液也出現大塊聚集和水-油分離的現象。第2次凍融后SLP（0）-HPMC乳液乳滴出現成片聚集，這是由于未經超聲處理的SLP與HPMC復合后其蛋白乳化性較差，乳液界面膜不穩定，冷凍時形成的冰晶極易刺穿界面膜，融化時油滴之間發生聚集[25]。隨著超聲功率的增大，這種不穩定現象逐漸減弱，較大功率下超聲處理的SLP形成的乳液與HPMC復合，乳液顆粒呈球形，且粒徑相對較小。SLP（400）-HPMC凍融后也發生了乳滴的部分絮凝和聚集，但粒徑增加較小。SLP（500）-HPMC乳液粒徑雖然最小，但水-油分離現象嚴重，已經不再是O/W乳液。因此，超聲功率400 W時，制備的超聲改性SLP-HPMC乳液穩定性最好。

圖 3 凍融循環前后超聲改性SLP-HPMC乳液的激光共聚焦顯微鏡圖Fig. 3 Confocal laser scanning microscopic images of sonicated SLP-HPMC emulsion before and after freeze-thaw cycles

2.4 循環凍融對超聲改性SLP-HPMC乳液乳液濁度、聚結度和出油率的影響

圖 4 循環凍融前后超聲改性SLP-HPMC乳液的濁度（A）、聚結度（B）、出油率（C）和實際外觀圖片（D）Fig. 4 Turbidity (A), aggregation degree (B), oil release rate (C) and appearance (D) of sonicated SLP-HPMC emulsion before and after freeze-thaw cycles

濁度與乳液的分散程度相關，能進一步反映乳液的穩定性。由圖4A可知，不同超聲功率改性SLP-HPMC初始乳液濁度類似，其中SLP（0）-HPMC乳液初始濁度為12 780.43±30.28，乳液均勻、無分層現象。經凍融循環后，部分乳液乳滴裂解，油相受疏水作用驅動重新絮凝沉降，乳液出現分層現象（圖4D），濁度明顯下降，經2 次凍融循環后SLP（400）-HPMC乳液濁度降低至2 744.61±18.72。結果表明，凍融循環對乳液濁度影響較明顯，通過簡單的混勻攪抖難以使乳液恢復其穩定性。

經過凍融循環后，乳液界面膜變得不穩定，油滴之間容易聚結。乳液的凍融循環次數越多，其聚結程度越大。由于超聲處理能夠將大分子質量蛋白變成分子質量相對較小的蛋白從而改變其柔性和空間結構[26]，更易與多糖結合形成致密的界面膜，從而有效抑制油滴聚集。由圖4B可知，經凍融循環后，超聲改性SLP-HPMC乳液聚結度明顯低于SLP（0）-HPMC乳液。隨著超聲功率的增大，聚結度呈現先減小后增大的趨勢，經過2 次凍融循環，SLP（400）-HPMC乳液聚結度仍保持最小，這可能是因為適度的超聲處理能暴露蛋白的疏水基團，使其更易吸附在油滴表面抵抗冷凍對乳液穩定性的破壞，從而增加乳液的凍融穩定性。

由圖4C可知，SLP（0）-HPMC乳液經2 次凍融循環后出油率由（0.3±0.2）%升高至（8.5±0.07）%，結合聚結度數據說明，此時乳液的界面膜不穩定，在凍融過程中易發生破裂。超聲改性SLP-HPMC乳液也發生不同程度地聚集，但游離油釋放量少于SLP（0）-HPMC乳液，而且隨著超聲功率的增大，超聲改性SLP-HPMC乳液中游離油釋放量先降低后升高，這與激光共聚焦掃描觀察與粒徑分析結果一致。游離油的產生是由于乳液在凍融處理的過程中降低了水相中自由水的含量，乳滴不穩定而相互靠近發生聚結，造成油脂釋放。

2.5 超聲功率對SLP二級結構的影響

圖 5 不同超聲功率下SLP的圓二色光譜圖Fig. 5 Circular dichroism spectra of SLP treated at different ultrasonic powers

表 1 不同超聲功率下SLP二級結構的相對含量變化Table 1 Relative contents of secondary structures in SLP treated at different ultrasonic powers

圓二色光譜是一種快速、準確、靈敏測定的蛋白二級結構技術，可以在水溶性蛋白溶液中直接測定并計算出蛋白各類型二級結構的相對含量[27]。不同超聲功率下SLP的圓二色光譜見圖5。由表1可知，經不同功率超聲處理后，SLP中各二級結構相對含量均發生明顯變化，400、500 W處理時SLP α-螺旋相對含量降低，β-折疊相對含量升高，這與前人研究結果一致，原因可能是超聲作用影響了α-螺旋結構中的疏水性氨基酸區域，從而使蛋白分子展開改變其空間構象[28-30]。但當高強度（500 W）超聲波作用于SLP后，蛋白質發生不溶性聚集，與HPMC間的相互作用減弱，因此α-螺旋結構又有一定程度地增加。蛋白的結構與其功能高度相關[28]，二級結構的改變使得SLP-HPMC復合物更具有均勻性和柔性的特點，使其在油-水界面上吸附更完全，這與本實驗中EAI分析結果一致。超聲功率為400 W時，SLP中β-折疊相對含量最高，更易于HPMC結合親水性氨基酸區域，從而形成穩定復合物，結合物吸附在油層表面再構成穩定乳液，從而提高了乳液的凍融穩定性。

3 結 論

不同超聲功率處理SLP不但可以增強SLP-HPMC乳液的EAI和ESI，還可以顯著提高乳液的凍融穩定性。不同功率的超聲改性SLP-HPMC乳液具有不同的凍融穩定性，SLP（400）-HPMC乳液經2 次凍融循環后乳滴聚結程度和出油率最小，穩定性較好，甚至2 次凍融循環后仍然可以觀察到明顯的O/W乳液結構。超聲處理改變了SLP二級結構的相對含量和柔性區間，400 W超聲處理SLP中β-折疊和β-轉角相對含量最大，β-折疊和β-轉角的松散結構使蛋白柔性增加，結構更易發生改變和伸展，進而影響乳液界面復合物的穩定性，說明乳液凍融穩定性與乳液界面層厚度和蛋白結構特性有關。