TiO2納米管負載米諾環(huán)素的釋放動力學研究

程佳蕙，吳雨峰，王澤華，高啟坤，吳明月,3

種植義齒已成為牙齒缺失的首選修復方法，但其仍存在有2%～3%的失敗率，種植體周圍炎被認為是口腔種植修復失敗的主要原因之一[1]，因此如何提高鈦種植體的抗菌性能，從而減少種植體周圍炎的發(fā)生，成為當前研究熱點。隨著種植體表面改性技術的發(fā)展，在含納米結(jié)構的鈦種植體表面構建局部藥物釋放體系已引起廣泛關注。TiO2納米管(TiO2nanotubes, TNT)具有比表面積大、多孔且結(jié)構均一、排列整齊、底端封閉等特點，可作為吸附藥物的良好載體[2]。該實驗在鈦表面制備出不同管徑的含有鹽酸米諾環(huán)素(minocycline hydrochloride, MH)修飾的TNT涂層，檢測MH載入不同管徑TNT后的載藥能力及緩釋特征。為種植體表面抑菌涂層研究提供新方法，并為種植體周圍炎的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑純度99.99%鈦箔片(北京中金研新材料科技有限公司)；丙酮、丙三醇、氟化銨(西隴化工股份有限公司)，MH、殼聚糖(上海科肽生物科技有限公司)，試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器LP6003D型直流穩(wěn)壓電源(深圳市樂達精密工具有限公司)；Sirion-200場發(fā)射掃描電鏡(FESEM,美國FEI公司)；X射線光電子能譜儀(XPS,美國Thermo-VG Scientific公司)；傅里葉紅外光譜(FTIR,美國Thermo-VG Scientific公司)；接觸角測量儀(成德市成慧試驗機器有限公司)；UV-1800紫外-可見分光光度計(日本島津公司)。

1.3 實驗過程

1.3.1鈦納米管的制備 將鈦箔片加工成直徑15mm、厚度0.25mm的圓形光滑鈦片，依次放入丙酮、75%無水乙醇、去離子水中，超聲清洗各20 min。再放入電解液為含0.27 mol/L氟化銨的丙三醇溶液(丙三醇溶液與雙蒸水的體積比為1 ∶1)中，采用陽極氧化法石墨接負極，鈦片接正極，調(diào)節(jié)直流穩(wěn)定電源電壓為10、20、30V的條件下分別3 h，以制備管徑30、70、120 nm的TNT。反應結(jié)束后將鈦片取出，大量雙蒸水清洗，干燥。

1.3.2實驗分組 鈦片組(A組)；30 nm TNT(B組)；70 nm TNT組(C組)；120 nm TNT(D組)。

1.3.2.1BCD組 制備1 g/L的MH溶液，然后將25 μl MH溶液移液到TNT表面并輕輕鋪展以確保均勻覆蓋，后置入冷凍干燥系統(tǒng)，在-45 ℃真空下冷凍干燥2 h，重復上述加載步驟，直至負載MH的量達到200 μg，在最后干燥步驟后，移取2 ml PBS快速沖洗表面以除去積聚在表面的藥物。

1.3.2.2BCD-MH組 配制10 mg/ml殼聚糖(chitosan，CHI)溶液：1%(kg/L)CHI+0.8%Vol乙酸置于去離子水中，將TNT基底固定在旋轉(zhuǎn)涂布機上, 將20 μl該聚合物溶液移液到鈦納米管表面,使CHI以轉(zhuǎn)速500 r/min涂層到基底上，涂布15 s，重復4次，然后在室溫中干燥。

1.3.3樣品的表征 FESEM觀察樣品表面形貌，并通過觀察其側(cè)方斷面測量TNT的高度；接觸角測量儀分析材料表面親水性：滴3 μl去離子水于鈦片表面，持續(xù)10 s，采集液滴影像并檢測；XPS、FTIR對樣品成分進行分析；紫外分光光度計檢測樣品表面MH的釋放曲線(將含有MH的樣品置于12孔板中，并加入1ml磷酸鹽緩沖液，放入溫度為37 ℃的恒溫搖床中，再分別于6、12、24 h、2、3、4～15 d取出200 μl釋放液以檢測其中MH的濃度，并重新加入200 μl新的PBS溶液)。

2 結(jié)果

2.1 鈦基材表面形貌表征FESEM顯示：光滑鈦片為鏡面狀；鈦納米管為蜂窩狀，管徑分別約為30、70、120 nm左右。見圖1。斷面顯示不同管徑鈦納米管的高度一致，約為700 nm。見圖2。

圖1 光滑鈦片及TNT的表面微觀結(jié)構 ×30 000A：光滑鈦片；B：30 nm TNT；C：70 nm TNT；D:120 nm TNT

2.2 載藥納米管表面形貌分析圖3A為載藥前TNT的表面形貌。當載入米諾環(huán)素后，納米管管腔及之間的孔隙被藥物充填，但管狀形貌依然存在。見圖3B。之后用CHI多層覆蓋后,納米管形貌消失，表面光滑平整。見圖3C。可見CHI多層的覆蓋起到了封堵納米管管口的作用，從而避免藥物的突釋。

2.3 材料表面親水性分析TNT組的接觸角明顯低于鈦片組(Ti)，表現(xiàn)出良好的親水性，且管徑越大，接觸角越小，親水性越大。加載MH后的TNT親水性降低，而覆蓋CHI后，親水性明顯減小，證明了CHI成功覆蓋TNT，差異均有統(tǒng)計學意義(F=433.014，P=0.00)。見表1。

表1 各樣品表面接觸角角度

2.4 XPS分析圖4A、B分別為TNT載藥前后的XPS譜圖，結(jié)果顯示載藥后N、C、Cl元素較載藥前均明顯上升，這與MH的分子式相吻合，見圖5。

2.5 FTIR檢測圖6A、B分別為TNT載藥前后的紅外光譜圖，載藥后，處于3 000 cm-1的譜帶為苯環(huán)的特征譜線，1 498 cm-1為苯環(huán)骨架C=C的特征帶，這與MH的結(jié)構式相吻合，見圖5。

2.6 MH的加載量與釋放曲線由圖7可見：3組樣品在24 h內(nèi)突釋較為明顯，在前9 d，藥物釋放量逐漸增加，釋放趨勢基本一致，而后釋放速度有所減慢，至13～15 d，釋放量不再增加。側(cè)面反映藥物的加載量，隨著管徑的的增加30、70、120 nm鈦納米管，載藥量分別為48.33、71.29、60.01μg。其中70 nm鈦納米管組載藥量最高，整個釋放過程較其它2組更為穩(wěn)定，至第15天時仍有少量釋放。

圖2 TNT的斷面結(jié)構 ×50 000A：30 nm TNT；B：70 nm TNT；C：120 nm TNT

圖3 TNT載藥后的表面微觀結(jié)構 × 100 000A: 30 nm TNT；B：TNT內(nèi)載入MH；C: 載藥后TNT表面覆蓋CHI多層

圖4 XPS分析圖譜A：TNT組；B：加載MH的TNT組

圖5 MH化學結(jié)構式

圖6 FTIR檢測結(jié)果A：TNT組; B：加載MH的TNT組

圖7 MH釋放曲線

3 討論

目前，提高鈦種植體抗菌性能的方法主要有2類：① 通過物理和化學方法，構建種植體預防感染表面以減少菌斑的附著。② 構建種植體抗菌表面以殺滅細菌，研究[3]證實，后者的抗菌效果更為持續(xù)有效。近年來，通過納米化修飾來進行鈦種植體表面改性成為研究的熱點內(nèi)容。TNT具有優(yōu)異的生物相容性，高比表面積，尺寸可控，是局部藥物輸送的良好載體。研究[4-5]顯示，藥物的載藥量及緩釋特征，涂層的抗菌效果及對細胞的功能作用隨著納米管管徑的不同而變化,適宜管徑的TNT能夠載負較大的藥物量，具備更佳的釋放效應，增加成骨相關細胞的活性，并且可抑制細菌的粘附。然而目前對于TNT最佳管徑的選擇尚存爭議，據(jù)此，本實驗采用陽極氧化法構建管徑分別為30、70、120 nm的TNT。SEM觀察呈特有的蜂窩管狀結(jié)構，其斷面高度一致，約700 nm。

大量研究[6]表明，防止細菌在種植體表面黏附是預防感染的關鍵。抗生素全身應用存在生物利用度差，選擇性不足，細胞毒性等缺點，為解決上述問題，將抗生素載入納米管腔，以降低細菌濃度、阻止細菌粘附到種植體表面來防止相關感染[7]。本實驗使用的抗生素為MH，顯著作用于兼性厭氧菌和厭氧菌，抗菌譜廣、耐藥菌株少，能殺死種植體周圍的致病菌并抑制細菌粘附到種植體表面[8]。其作用機制是防止細菌蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮抗菌作用，抑制牙周組織膠原酶活性，減少牙槽骨吸收[9]。研究[10]顯示，MH對牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等種植體周圍炎優(yōu)勢菌的最小抑菌濃度為0.25 μg/ml。因此，本研究采用TNT為基材將MH加載至納米管表面，通過XPS及FTIR檢測，證實實驗組樣品表面成功加載MH。

盡管TNT是吸附藥物的良好載體，但載入管腔中的抗生素會產(chǎn)生早期突釋現(xiàn)象，造成局部藥物濃度降低至最低殺菌濃度而引發(fā)感染，而過高抗生素濃度也會導致細胞毒性反應[11-12]。據(jù)此，本實驗將CHI多層覆蓋到負載MH的TNT表面，封堵TNT管口，以達到MH的控制釋放。SEM顯示納米管形貌消失，表面光滑平整。CHI為N-乙酰葡萄糖胺單體構成的聚合物，是一種天然陽離子多糖。可與各種生物活性材料結(jié)合使用，具備無毒性，生物降解性，抗菌活性及良好的成膜性能等，廣泛應用于生物工程和再生醫(yī)學等領域[13]。

為比較不同管徑的緩釋效果，本實驗進行了MH的釋放動力學測定，由釋放曲線可見：70 nm TNT組的載藥量最高，至15 d仍有少量釋放，其次為120 nm TNT組、30 nm TNT組。由以上規(guī)律可知，當TNT管徑較小時，會阻止藥物分子進入管腔內(nèi)部而使載藥量降低，而管徑過大，鈦納米管的比表面積降低，載藥量反而下降。

因此，本研究在鈦表面制備出不同管徑的含有MH修飾的TNT涂層，實現(xiàn)米諾環(huán)素的有效荷載，并涂覆CHI多層膜構建緩釋系統(tǒng)，檢測米諾環(huán)素載入不同管徑TNT后的載藥能力及緩釋特征，其中，70nm管徑的TNT的載藥量最大，緩釋效果最好，為種植體表面抑菌改性及種植體周圍炎的防治提供新的方法與思路。