蟲草素抑制PI3K通路的活化誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC9細(xì)胞自噬性死亡

朱蘭省，王艷玲，劉愛群，許小婷

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病總量約占到口腔癌的90%[1]。在全世界范圍內(nèi)，OSCC發(fā)病率為2%～4%，在南亞發(fā)病率則上升至10%～40%；這一現(xiàn)象的主要原因可能與南亞地區(qū)人民大量食用檳榔果有極大關(guān)系[2]。雖然患者大多屬于50歲以上人群，但是患病人群越來越趨向于年輕化[3]。蟲草素(cordycepin，CP)是一種3′-脫氧腺苷(3′-deoxyadenosine)，由Cunningham et al[4]首次在蛹蟲草(Cordysepsmilitaris)中培育分離得到。近些年來，經(jīng)過大量國內(nèi)外科學(xué)家證實(shí)，CP作為一種核苷酸，具有諸多生物學(xué)功能，如抑菌抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能、對抗炎癥反應(yīng)以及抗腫瘤作用等[5]。Wong et al[6]研究證實(shí)CP可以通過縮短mRNA的polyA進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞黏附能力。磷脂肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，亦稱Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路是生物體細(xì)胞內(nèi)一經(jīng)典信號通路，自發(fā)現(xiàn)以來在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用即被廣泛研究，已經(jīng)在多數(shù)腫瘤里呈不同程度高表達(dá)或異常活化[7-8]。有研究[9]顯示，Muc-1可以通過PI3K-Akt途徑來促進(jìn)OSCC轉(zhuǎn)移和侵襲。截止目前，OSCC發(fā)病機(jī)制也不甚清楚，因此如何明確OSCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找其中潛在的分子標(biāo)志物，對進(jìn)一步提高OSCC患者的治療和預(yù)后效果具有重要研究意義。現(xiàn)根據(jù)前期研究成果，探討CP在OSCC細(xì)胞中所發(fā)揮的功能機(jī)制，期望為OSCC治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶均購自美國Gibco公司；Hoechst 33342染色試劑盒(貨號：ab228551)購自英國abcam公司；蟲草素(貨號：C9137-1MG，純度≥95%)、EdU 染液試劑盒(貨號：900584)購自美國sigma公司；Ki67(貨號：ab16667)、PCNA(貨號：ab29)、Caspase-3(貨號：ab13847)、Caspase-9(貨號：ab32539)、Beclin 1(貨號：ab207612)、p62(貨號：ab56416)、LC3A/B(貨號：ab128025)、PI3K(貨號：ab32089)、p-PI3K(貨號：ab182651)、AKT(貨號：ab8805)、p-AKT(貨號：ab131443)、mTOR(貨號：ab2732)、p-mTOR(貨號：ab109268)、GAPDH一抗(貨號：ab181062)購自美國abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；LY294002(貨號：S1737)購自上海亞培生物科技有限公司。

1.2 主要儀器半干轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀以及PCR儀均購于美國伯樂公司； Multiskan GO酶標(biāo)儀購自美國Thermo；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購于廣州云星儀器有限公司；分析天平ME204購自梅特勒托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；生物安全柜HR30-IIA2、-86 ℃超低溫冰箱DW-86L578J、-25 ℃低溫保存箱DW-25L262h和2～8 ℃醫(yī)用冷藏箱HYC-310購自河南鄭州海爾公司；Eppendorf臺式冷凍離心機(jī)5702R購自德國艾本德股份公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1EdU染色 將對數(shù)生長期細(xì)胞8×103個(gè)/孔 接種于96孔板，過夜培養(yǎng)；經(jīng)過24 h CP處理后，用完全培養(yǎng)基按照1 000 ∶1比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量50 μmol/L EdU培養(yǎng)基；每孔加入100 μl的50 μmol/L的EdU培養(yǎng)基進(jìn)行2 h孵育。棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次，每次5 min。各孔加入100 μl的細(xì)胞固定液在室溫下孵育30 min，加2 mg/ml的甘氨酸，脫色搖床進(jìn)行孵育5 min；各孔加100 μl PBS緩沖液，脫色搖床進(jìn)行孵育5 min。各孔加入100 μl 1×Apollo染色反應(yīng)液后，室溫避光下脫色搖床孵育30 min。去除染色反應(yīng)液，加100 μl滲透劑在脫色搖床清洗2次，每次10 min。準(zhǔn)備后續(xù)Hoechst染色。

1.3.2Hoechst染色 對藥物處理的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行染色處理：吸盡培養(yǎng)液后加入0.5 ml固定液固定10 min；去除固定液用PBS洗兩遍，每次3 min；加入0.5 ml Hoechst染色液染色5 min；用PBS洗2遍，每次3 min；滴加抗熒光淬滅封片液蓋上蓋玻片熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3免疫熒光染色 操作步驟按照說明書進(jìn)行，細(xì)胞接種于預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被的蓋玻片，經(jīng)藥物處理后，進(jìn)入4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗，用含Triton X-100封閉液在冰上通透5 min；吸掉通透液，加入預(yù)溫的封閉液，室溫下封閉1 h； 孵育一抗4 ℃過夜。次日，PBS漂洗，孵育熒光標(biāo)記的二抗(濃度為1 ∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，50%甘油-指甲油封片，立即避光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.4Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá) 收集四組細(xì)胞，PBS清洗3次，用添加有終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，提取各組細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度(具體檢測按照試劑說明書進(jìn)行)，10% SDS-PAGE膠分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5% 脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4 ℃封閉過夜，第2天加入對應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影。SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5% BSA封閉后依次孵育相應(yīng)一抗和二抗。顯色并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CP抑制SCC9細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡EdU染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常SCC9 blank組相比，CP各組EdU陽性細(xì)胞所占比率均有不同程度的降低(t=6.445，P<0.01，n=10；t=18.064，P<0.01，n=10；t=36.200，P<0.01，n=10)，見圖1；隨著CP使用濃度逐漸升高，EdU陽性細(xì)胞所占比率逐漸下降。

Hoechst染色實(shí)驗(yàn)顯示：正常SCC9 blank組細(xì)胞形態(tài)均勻一致，幾乎沒有皺縮等形態(tài)；與正常SCC9 blank組比較，隨著CP給藥濃度逐漸增大，各用藥組SCC9細(xì)胞核逐漸凝聚，細(xì)胞皺縮，Hoechst染色逐漸加深。與正常SCC9 blank組相比，CP各組細(xì)胞凋亡率均有不同程度的升高(t=7.192，P<0.01，n=10；t=18.064，P<0.01，n=10；t=26.964，P<0.01，n=10)，見圖2；隨著CP使用濃度逐漸升高，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。

Western blot檢測顯示：與正常SCC9 blank組細(xì)胞相比，隨著CP給藥濃度逐漸增大，細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)因子Ki67(t=5.542，P<0.01，n=10；t=36.948，P<0.01，n=10；t=56.374，P<0.01，n=10)和PCNA(t=10.172，P<0.01，n=10；t=38.105，P<0.01，n=10；t=49.760，P<0.01，n=10)表達(dá)水平逐漸降低，而凋亡相關(guān)因子Caspase-3(t=0.456，P<0.01，n=10；t=21.073，P<0.01，n=10；t=41.678，P<0.01，n=10)和Caspase-9(t=0.992，P<0.01，n=10；t=28.987，P<0.01，n=10；t=58.024，P<0.01，n=10)則逐漸上調(diào)(P<0.01)，見圖3。

2.2 CP促進(jìn)SCC9細(xì)胞自噬Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，與正常SCC9 blank組細(xì)胞比較，隨著CP給藥濃度逐漸增大，各用藥組SCC9細(xì)胞中自噬抑制相關(guān)因子Beclin 1(t=14.697，P<0.01，n=10；t=5.146，P<0.01，n=10；t=12.281，P<0.01，n=10)和LC3-II(t=3.386，P<0.01，n=10；t=42.449，P<0.01，n=10；t=7.382，P<0.01，n=10)表達(dá)量逐漸上調(diào)；而促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白p62(t=11.024，P<0.01，n=10；t=12.639，P<0.01，n=10；t=16.246，P<0.01，n=10)表達(dá)量則逐漸下降(P<0.01)，見圖4。

2.3 CP促進(jìn)SCC9細(xì)胞LC3+自噬細(xì)胞比例免疫熒光染色鑒定LC3+細(xì)胞量，正常SCC9 blank組細(xì)胞質(zhì)中很少含有聚集的染色亮點(diǎn)；與正常SCC9 blank組細(xì)胞比較，隨著CP給藥濃度逐漸增大，各用藥組SCC9細(xì)胞質(zhì)中熒光亮點(diǎn)數(shù)目逐漸增加，同時(shí)伴有熒光亮點(diǎn)面積逐漸增加(t=14.037，P<0.01，n=10；t=39.413，P<0.01，n=10；t=46.135，P<0.01，n=10)。見圖5。

圖1 不同處理組EdU染色鑒定細(xì)胞增殖×200A：SCC9 blank組；B：CP(5 μg/ml)組；C：CP(10 μg/ml)組；D: CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01

圖2 Hoechst染色檢測SCC9細(xì)胞凋亡×200A：SCC9 blank組；B：CP(5 μg/ml)組；C：CP(10 μg/ml)組；D: CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01

圖3 Western blot檢測細(xì)胞增殖和凋亡蛋白表達(dá)A：SCC9 blank組；B：CP(5 μg/ml)組；C：CP(10 μg/ml)組；D: CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01

2.4 CP抑制SCC9細(xì)胞中PI3K通路活性為了進(jìn)一步探究CP對SCC9細(xì)胞的作用機(jī)制，通過Western blot檢測不同處理組細(xì)胞中PI3K通路相關(guān)分子活性情況。與SCC9 blank組細(xì)胞比較，隨著CP給藥濃度逐漸增大，各用藥組SCC9細(xì)胞中自噬通路相關(guān)基因PI3K、AKT及mTOR分子表達(dá)激活水平逐漸受到抑制(t=7.257，P<0.01，n=10；t=18.064，P<0.01，n=10；t=21.411，P<0.01，n=10；t=6.521，P<0.01，n=10；t=14.589，P<0.01，n=10；t=22.759，P<0.01，n=10；t=6.653，P<0.01，n=10；t=15.726，P<0.01，n=10；t=23.508，P<0.01，n=10)，見圖6，在20 μg/ml組時(shí)達(dá)到最強(qiáng)。

2.5 CP通過抑制PI3K通路抑制SCC9細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、自噬添加PI3K通路抑制劑LY294002后，EdU染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常SCC9 blank組相比，LY294002組和CP(20 μg/ml)組EdU陽性細(xì)胞所占比率均有明顯降低(t=14.589，P<0.01，n=10；t=18.064，P<0.01，n=10)，與CP(20 μg/ml)組相比，LY294002+CP(20 μg/ml)組EdU陽性細(xì)胞所占比率明顯降低(t=3.386，P<0.01，n=10)，見圖7。

添加PI3K通路抑制劑LY294002后，Hoechst染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常SCC9 blank組相比，LY294002組和CP(20 μg/ml)組Hoechst陽性細(xì)胞所占比率均有明顯升高(t=11.265，P<0.01，n=10；t=7.156，P<0.01，n=10)，與CP(20 μg/ml)組相比，LY294002+CP(20 μg/ml)組Hoechst陽性細(xì)胞所占比率明顯升高(t=3.413，P<0.01，n=10)，見圖8。

添加PI3K通路抑制劑LY294002后，免疫熒光染色鑒定LC3+細(xì)胞量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常SCC9 blank組相比，LY294002組和CP(20 μg/ml)組熒光亮點(diǎn)數(shù)目明顯升高(t=24.798，P<0.01，n=10；t=31.654，P<0.01，n=10)，與CP(20 μg/ml)組相比，LY294002+CP(20 μg/ml)組熒光亮點(diǎn)數(shù)目明顯升高(t=5.122，P<0.01，n=10)，見圖9。

圖4 Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平A：SCC9 blank組；B：CP(5 μg/ml)組；C：CP(10 μg/ml)組；D: CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01

圖5 免疫熒光檢測LC3+細(xì)胞表達(dá)分布×200A：SCC9 blank組；B：CP(5 μg/ml)組；C：CP(10 μg/ml)組；D: CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01

圖6 Western blot檢測各處理組自噬通路相關(guān)分子活性A：SCC9 blank組；B：CP(5 μg/ml)組；C：CP(10 μg/ml)組；D: CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01

圖7 不同處理組EdU染色鑒定細(xì)胞增殖 ×200A：SCC9 blank組；B：LY294002組；C： CP(20 μg/ml)組；D： LY294002+CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01；與CP(20 μg/ml)組比較：##P<0.01

圖8 Hoechst染色檢測SCC9細(xì)胞凋亡 ×200A：SCC9 blank組；B：LY294002組；C： CP(20 μg/ml)組；D： LY294002+CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01；與CP(20 μg/ml)組比較：##P<0.01

圖9 免疫熒光檢測LC3+細(xì)胞表達(dá)分布 ×200A：SCC9 blank組；B：LY294002組；C： CP(20 μg/ml)組；D： LY294002+CP(20 μg/ml)組；與SCC9 blank組比較：**P<0.01；與CP(20 μg/ml)組比較：##P<0.01

3 討論

鱗狀細(xì)胞癌一般發(fā)生于口腔黏膜和頜面部皮膚部位的鱗狀上皮中，病理學(xué)表現(xiàn)主要為：增生性鱗狀上皮在侵犯周圍結(jié)締組織后形成原位癌。鱗狀細(xì)胞不是角化形態(tài)時(shí)，有可能會同時(shí)具有多形性細(xì)胞，這種細(xì)胞具有惡性程度較高，稱為無角化的鱗狀細(xì)胞癌。不良的生活習(xí)慣會導(dǎo)致OSCC發(fā)生，如吸煙、飲酒、嚼檳榔等[10]。隨著治療OSCC的不斷發(fā)展，相關(guān)治療手段已不僅局限在手術(shù)治療，還可以結(jié)合化療、放療等其他治療方式。但仍有60%以上的患者病情不能得到有效的控制，術(shù)后生存率低于50%[11]。

植物藥中具有抗腫瘤功效的藥品因良好效用和相對微小毒副作用逐漸受到人們關(guān)注。近些年來，經(jīng)過大量國內(nèi)外科學(xué)家證實(shí)，CP作為一種核苷酸，具有諸多生物學(xué)功能，如抑菌抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能、對抗炎癥反應(yīng)以及抗腫瘤作用等[5]。CP的抗腫瘤機(jī)制復(fù)雜，諸多學(xué)者證實(shí)因同腺苷結(jié)構(gòu)類似，CP可以參與DNA或RNA的生物合成中，但體內(nèi)多數(shù)酶無法將腺苷與CP進(jìn)行區(qū)別，從而終止堿基合成[12]。Zheng et al[13]研究者證實(shí)CP可以在舌癌中抑制AMPK-mTOR通路來抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。該研究利用Western blot和免疫熒光等技術(shù)對Beclin 1、p62及LC3 Ⅱ和上游信號分子進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CP可以有效影響自噬相關(guān)標(biāo)記分子和上游信號分子的活性，促進(jìn)自噬發(fā)生。同時(shí)還檢測到增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA表達(dá)在經(jīng)過CP處理后發(fā)生明顯下調(diào)，說明OSCC的增殖能力也受到影響。

PI3K-蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路是生物體細(xì)胞內(nèi)一經(jīng)典信號通路，自發(fā)現(xiàn)以來在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用即被廣泛研究，已經(jīng)在多數(shù)腫瘤里呈不同程度高表達(dá)或異常活化[7-8]。丹參酮IIA可以通過誘導(dǎo)Beclin 1-Atg5通路和抑制PI3K-Akt- mTOR通路來促進(jìn)腫瘤自噬發(fā)生[14]。也有研究[15]證明CP可以下調(diào)p38 AMPK和PI3K-Akt通路活性來誘導(dǎo)小鼠睪丸癌發(fā)生凋亡。本研究顯示，在正常OSCC中，PI3K-Akt-mTOR通路活性均呈高度異常激活，當(dāng)使用CP處理后，三者活性水平均有所下調(diào)，并且隨著CP使用濃度升高三者活性降低水平越低。這一結(jié)果充分說明較高濃度CP可以有效降低OSCC細(xì)胞中PI3K-Akt- mTOR通路的活性水平。另外，利用免疫熒光技術(shù)鑒定不同處理組OSCC中LC3+的比例發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞進(jìn)行CP處理后，有較多的細(xì)胞呈現(xiàn)LC3+表達(dá)，并且在不同濃度組細(xì)胞中呈現(xiàn)出高比例的LC3+細(xì)胞；同時(shí)利用Western blot對自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、p62和LC3 Ⅱ的表達(dá)水平也進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)不同濃度組CP處理可以有效對相應(yīng)分子發(fā)生逆轉(zhuǎn)；以上結(jié)果充分證明有較多的細(xì)胞啟動(dòng)自噬程序。說明不同濃度CP可能通過降低PI3K-Akt- mTOR來啟動(dòng)OSCC自噬發(fā)生。

綜上，CP對OSCC細(xì)胞具有很好的促自噬和生長抑制效果。主要體現(xiàn)在CP處理OSCC后，可以有效降低細(xì)胞內(nèi)PI3K-Akt-mTOR通路分子活性，并激活下游相應(yīng)自噬相關(guān)的標(biāo)志分子表達(dá)。同時(shí)CP處理還有效降低癌細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA的表達(dá)，進(jìn)一步抑制癌細(xì)胞的增殖能力。本研究通過CP處理OSCC后顯著激活細(xì)胞自噬，并可以抑制癌細(xì)胞增殖能力的結(jié)果顯示，CP對闡明OSCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找其中潛在的分子標(biāo)志物，對進(jìn)一步提高OSCC患者的治療和預(yù)后效果具有重要的研究意義。