TRIM59在非小細胞肺癌中的表達、臨床意義及與c-myc、CDC25A蛋白的相關性研究

李 琛，楊曉光，錢海紅，陳麗萍，蘇 菁，馮 萍，侯海軍，張志華

據最新流行病學調查顯示，2014年我國居民肺癌發病和死亡例數均位居第一位，嚴重威脅國民健康[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌總數的85%以上，其生長分裂增殖較慢，轉移擴散較晚。近年來，盡管NSCLC診療手段不斷提高，但其五年生存率仍較低。從分子生物學水平，尋找敏感度高、特異性強的標志物已成為NSCLC早期診斷、治療評估和預后監測的研究熱點，同時為腫瘤的放化療、靶向治療提供新的技術支撐[2-3]。

三結構域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)系TRIM蛋白超家族的重要成員之一，于2011年由Valiyeva et al[4]首次在小鼠前列腺癌癥模型中證實其是致癌基因，在隨后的研究中逐漸證實TRIM59在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移等過程中發揮重要作用[5-7]。但TRIM59在NSCLC組織中的研究較少，且相關致癌機制不明確。該研究通過RT-PCR法和免疫組化法檢測TRIM59基因和蛋白在NSCLC組織中的表達，分析TRIM59蛋白與NSCLC臨床病理特征和細胞周期相關蛋白c-myc、CDC25A的相關性，初步探討TRIM59的致癌機制，并結合生存時間的隨訪，為NSCLC的早期診斷、治療和預后監測提供準確、可靠的生物學指標。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究共納入2012年2月～2014年2月于河北北方學院附屬第一醫院病理確診的NSCLC組織和正常肺組織標本各40例，同時收集患者完整的臨床資料，本研究經該院倫理委員會鑒定批準。

1.2 主要試劑與實驗方法

1.2.1主要試劑和儀器 RNA逆轉錄試劑購自日本Takara公司；SYBR Green實時定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；TRIM59和GAPDH引物由生工生物(北京)有限公司設計合成；全自動電化學發光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司；E2010、DEPC水購自美國Sigma公司；RNA逆轉錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；兔抗人TRIM59單克隆抗體、兔抗人c-myc、CDC25A多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2RT-PCR法檢測TRIM59 mRNA表達 提取總RNA并定量，反轉錄為cDNA。TRIM59引物，上游5′-CCTGTGTTTGAGATAGATTTAAGAGC-3′，下游5′-GCAACAAGGTGAGACCCAGT-3′；GAPDH引物，上游5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游5′-TCACACCCATGACGAACA-3′。

PCR反應試劑：SYBR Premix Ex Taq 5 ml，PCR forward primer 0.2 μl，PCR reverse primer 0.2 μl，ROX Reference Dye 0.2 μl，cDNA 模板100 ng，DEPC水共10 μl。輕柔混勻，離心。PCR反應體系，95 ℃孵育30 s；95 ℃孵育5 s，60 ℃孵育20 s，反應共進行40個循環；然后72 ℃孵育20 s，95 ℃孵育15 s終止反應。熒光定量PCR實驗數據處理使用2ΔΔCt法，計算各樣本Ct平均值(Ct=Ctnetl-Ctl3actin)。其中，中位數以上為高表達，以下則考慮低表達。

1.2.3免疫組化法檢測TRIM59的表達及判定 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色，病理診斷。80 ℃烤箱烘烤30 min，脫水，內源性過氧化物酶滅活，高溫高壓水化修復；加入一抗(1 ∶ 400)50 μl，4 ℃冰箱中孵育過夜；加入二抗50 μl，DAB顯色，蘇木精輕度復染，鹽酸乙醇分化，各級乙醇(70%、75%、85%、90%、95%、100%)逐次脫水，松節油透明和樹膠行封片處理，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察。

應用半定量積分法，包括陽性細胞數占視野百分比與陽性強度，TRIM59、c-myc蛋白以細胞質中出現黃色、棕黃色為陽性表達，而CDC25A染色主要定位于細胞核，其中陽性細胞計分：≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。陽性強度：淺黃色計1分，黃色計2分，紅褐色計3分。二者相乘計為總分，0分計為-，1～4分計為+，5～8分計為，9～12分計為，-為陰性，+為弱陽性，～為強陽性。

1.3 隨訪通過門診復查、電話隨訪，時間為2018年11月30日。

2 結果

2.1 RT-PCR法檢測TRIM59 mRNA表達以TRIM59/GAPDH比值作為RT-PCR定量分析，與TRIM59 mRNA在正常組中的表達相比，NSCLC組中TRIM59 mRNA的表達水平明顯升高，差異有統計學意義(t=2.901，P=0.002)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測NSCLC組和正常組中的TRIM59 mRNA表達情況與正常組比較：*P<0.05

2.2 免疫組化檢測TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白的表達與TRIM59、c-myc、CDC25A在正常組中陽性表達水平[15.00%(6/40)、10.00%(4/40)、17.50%(7/40)]相比，三者在NSCLC組陽性表達[72.50%(29/40)、67.50%(27/40)、60%(24/40)]明顯升高，差異有統計學意義(χ2=31.775，χ2=35.419，χ2=28.916，P=0.000)。見圖2。

2.3 NSCLC組織中TRIM59的表達與臨床病理參數之間的關系NSCLC組中TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白的表達水平均與病變分化程度、TNM分期、脈管浸潤、淋巴結轉移及肝轉移相關(P<0.05)，而與年齡、性別無關(P>0.05)。見表1。

2.4 NSCLC組織中TRIM59的表達與c-myc、CDC25A蛋白表達的相關性NSCLC組中TRIM59蛋白的表達與c-myc蛋白表達呈明顯正相關(r=0.451，P=0.000)，而與CDC25A蛋白的表達亦呈明顯相關性(r=0.421，P=0.002)。

2.5 TRIM59蛋白的表達情況與NSCLC患者生存的相關性分析TRIM59陽性組患者5年死亡率為65.52%(19/29)，而陰性組患者為36.36%(4/11)，差異有統計學意義(χ2=15.275，P=0.000)；生存曲線結果顯示，TRIM59陽性組中位生存期為29個月，而TRIM59陰性組為56個月，差異有統計學意義(χ2=10.275，P=0.003)。見圖3。

圖2 免疫組化檢測正常組和NSCLC中TRIM59、c-myc、CDC25A的陽性表達 SP×200A：TRIM59在正常組中的陽性表達；B：TRIM59在NSCLC中的陽性表達；C：c-myc在正常組中的陽性表達；D：c-myc在NSCLC中的陽性表達；E：CDC25A在正常組中的陽性表達；F：CDC25A在NSCLC中的陽性表達

圖3 TRIM59蛋白表達與NSCLC患者生存期的相關性

2.6 Cox回歸分析Cox回歸模型分析顯示，TRIM59表達水平(P=0.002)、脈管浸潤(P=0.001)、淋巴結轉移(P<0.001)、肝轉移和TNM分期(P<0.001)均是影響NSCLC患者預后的獨立因素。見表2、3。

3 討論

三結構域蛋白家族(tripartite motif，TRIM)是一個在進化中高度保守的基因家族，由70多個成員組成，參與了多種細胞的生長、分化、發育的過程，同時在細胞凋亡、炎癥和免疫應答過程中亦發揮重要作用[8]。TRIM家族蛋白最顯著的結構特征是包括一個環狀結構域(really interesting new gene,RING)、一個或兩個B-box結構域(B-box domain)和一個盤繞區域(coiled-coil domain)。RING結構域是半胱氨酸富集的鋅離子結合域，具有廣泛的泛素化酶活性；B-box結構域參與蛋白之間的相互連接；盤繞區域能夠介導成員自身發生同源寡聚，參與蛋白鏈接[9]。

表2 NSCLC組織中TRIM59與c-myc蛋白表達的相關性

表3 NSCLC組織中TRIM59與CDC25A蛋白表達的相關性

TRIM59亦稱為MRFI，位于人類第3號染色體上，屬于C-XI亞家族成員， 除了繼承高度保守的三段結構域外，在其C端還有一個涉及蛋白跨膜定位的TM 結構域，參與TRIM59的定位。TRIM59蛋白位于細胞內質網膜上，內含403個氨基酸殘基，通過介導蛋白之間的相互作用，泛素化調控蛋白的穩定性，促進腫瘤細胞的無序化增殖[10]。研究[11]證實，TRIM59通過參與NF-κB和IRF3/IRF7介導的信號通路的活化，發揮免疫信號的負性調節作用。TRIM59參與SV40 Tag/p53/pRB和Ras/ERK/PI3K/AKT兩種致癌信號通路，調控細胞周期S期的DNA合成，促進細胞分裂增殖，同時能上調細胞周期相關蛋白的表達，最終誘導腫瘤形成[12]。

c-myc是myc家族中的重要成員，能誘導細胞增殖，促進其永生化、去分化和功能轉化，在多種腫瘤形成過程中發揮重要作用。CDC25A是CDC25家族中重要成員，能加速細胞由G1期進入S期，從而增加細胞DNA的合成，使癌細胞獲得高增殖活性；同時能消除ATP錨定模序上Thr-14和Thr-15的磷酸化抑制，在細胞周期運轉中發揮正性調控作用。

本研究從基因水平證實了在NSCLC組織中TRIM59 mRNA表達水平明顯高于正常組織，免疫組化結果證實TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白表達水平均明顯高于正常組織，同時TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白表達水平均與病變分化程度、TNM分期、脈管浸潤、淋巴結轉移及肝轉移情況密切相關，進一步相關分析表明TRIM59表達與c-myc、CDC25A均呈明顯正相關，提示TRIM59表達的異常在NSCLC發生過程中發揮重要作用，且與腫瘤的惡性生物學行為密切相關，其致癌機制考慮與誘導c-myc、CDC25A蛋白上調有關。Hao et al[13]研究證實TRIM59 mRNA在NSCLC組織中的表達水平顯著高于正常肺組織，且與吸煙、病變分期相關；Zhan et al[14]報道了TRIM59蛋白在各種非小細胞肺癌細胞系中的表達顯著上升，而siRNA誘導TRIM59的下降在G2期抑制細胞周期中顯著抑制NSCLC細胞系的增殖和遷移，此外，TRIM59能影響許多細胞周期的蛋白質，包括CDC25C和CDK1的表達；國內薛棟 等[15]通過免疫組化法證實肝癌組織中TRIM59的表達明顯高于正常肝組織，TRIM59異常表達與肝癌的發生及分化程度、分期相關，其致癌機制考慮與誘導Twist 表達上調和E-cadherin表達下調有關，以上研究均支持本研究結果。

本研究進一步通過隨訪證實，TRIM59陽性患者死亡率明顯高于陰性患者，且TRIM59陽性表達患者生存期明顯短于陰性表達者，表明TRIM59的表達水平可作為NSCLC患者的重要預后監測指標，同時Cox回歸模型分析亦證實TRIM59表達水平是影響NSCLC患者預后的獨立因素。