CD39-腺苷能軸在纖維化疾病中作用的研究進展

帥 陳 綜述 慈雷雷，賈文茜，呂雄文 審校

肌成纖維細胞是由多種細胞如常駐間充質細胞、上皮細胞以及內皮細胞等分化而來的平滑肌表型的成纖維細胞，是膠原蛋白的主要來源，在纖維化的發展中起著重要作用[1]。許多生長因子在組織修復和再生中發揮重要的作用，其中轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)就能夠調節細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的表達。ECM(膠原蛋白I和膠原蛋白Ⅲ等)具有結構支持、細胞黏附以及阻礙流體和大分子運動的作用，在特定的器官組織中表達特殊的功能。在動物體內，TGF-β和其他細胞因子(纖溶酶和基質金屬蛋白酶等)控制基質蛋白的退化和重塑平衡[2]。α平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)是能夠收縮平滑肌細胞的骨架蛋白。在激活狀態下，肌成纖維細胞能夠停止增殖，大量表達α-SMA[3]。肌成纖維細胞產生的高收縮力有利于組織的生理重塑，能夠通過收縮傷口邊緣來加速傷口的修復，但是當肌成纖維細胞過度收縮時就會出現增生性瘢痕，不利于組織修復。因此，在研究纖維化疾病過程中常常把TGF-β、α-SMA、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ作為評判纖維化的重要指標。

纖維化疾病的發生受多種因素的調控，其中嘌呤核苷酸發揮著至關重要的作用。三磷酸二磷酸水解酶(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 ENTPD1/CD39)和5’-核苷酸酶(ecto-5’-Nucleotidase,NT5E/CD73)介導細胞外的嘌呤代謝，將細胞外的嘌呤信號傳遞給免疫細胞上的4個蛋白偶聯P1腺苷受體[4]，這個過程在多種病理生理中發揮作用。CD39-腺苷能軸在多種人類疾病中的作用使得研究人員越來越意識到通過改變相關通路的分解代謝機制就可以改變某些纖維化疾病的病理生理進程或者逆轉結果。因此CD39-腺苷軸在纖維化疾病中的研究成為現階段的研究熱點。

1 CD39-腺苷軸

細胞外的腺苷主要來源途徑分別為：① 細胞內產生的腺苷運輸到細胞外；② 細胞外的嘌呤核苷酸水解產生。參與細胞外嘌呤代謝的酶有很多種，其中研究最多的是CD39和CD73。CD39參與嘌呤核苷酸代謝第一步水解。CD39是一種含有510個氨基酸、具有特殊結構特征的細胞膜蛋白，分子量為70 ～ 100 ku。分子中含有6個潛在的N-鏈糖基化位點，11個半氨酸殘基和2個跨膜區域。其中，2個跨膜結構域分別是由含有氨基和羧基末端片段的細胞質結構域和對酶分解代謝功能至關重要的細胞外疏水結構域組成。CD39在動物體大部分器官中均有表達，主要是在內皮細胞和免疫細胞上表達。CD73參與嘌呤核苷酸代謝的第2步水解。CD73是一種糖基-磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨定蛋白，是由548個氨基酸組成的二聚體，其分子量約為61 ku。CD73分子N段區域結合二價金屬離子，而C端結合單磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)，主要存在于多種組織中，包括結腸、大腦、心肝肺等[5]。

當細胞受到刺激時，細胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)從細胞內釋放到細胞外，迅速被細胞表面的CD39酶水解生成AMP和磷酸并釋放能量，隨之由下游CD73酶將胞外的AMP水解為腺苷，釋放能量[6]。產生的腺苷在腺苷水解酶(adenosine deaminase, ADA)的作用下發生水解或者與靶細胞膜上4個G蛋白偶聯腺苷受體(分別為A1R、A2R、A3R和A4R)結合發揮生理效應。這個途徑從ATP到腺苷的生成，被稱為CD39-腺苷能軸。正常情況下，胞外酶CD39-CD73-ADA級聯反應共同調控腺苷水平，使得體內的腺苷水平處于一個相對穩定的狀態。當組織損傷、惡性腫瘤以及自身免疫性疾病等使得人體內環境發生紊亂時，體內腺苷水平穩態被打破，大量釋放的腺苷直接或者間接的作用激活腺苷受體，引發一系列下游信號通路，調控免疫應答和炎癥反應，如圖1。因此腺苷在參與傷口愈合、組織修復以及纖維化中發揮著重要的作用[7]。CD39-腺苷能軸在纖維化疾病治療過程中具有巨大的臨床潛力。

圖1 CD39-腺苷能軸調控細胞活化增殖和纖維化的作用機制示意圖

2 CD39-腺苷能軸在纖維化疾病中的作用

2.1 CD39-腺苷能軸在皮膚纖維化中的作用皮膚纖維化是以膠原為主的ECM過度聚集在皮膚組織中所出現的一種疾病。在對小鼠進行CD39/CD73基因雙重敲除后，皮膚抗拉伸強度明顯要比野生型小鼠強，TGF-β和結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)的含量減少[8]。CD39/CD73能夠產生細胞外腺苷，在博來霉素誘導的真皮損傷甚至真皮纖維化中起重要作用，可能引起皮膚纖維化。CD39或CD73基因敲除的小鼠因嘌呤核苷酸無法水解產生細胞外腺苷，從而明顯緩解皮膚纖維化。CD39或CD73的抑制劑有希望治療皮膚纖維化。

2.2 CD39-腺苷能軸在心肌纖維化中的作用心肌纖維化是指心肌成纖維細胞在心肌組織中活化增殖，致ECM過度沉積，導致心室僵硬以及功能障礙，心臟出現不可逆轉的心力衰竭。心肌成纖維細胞上的CD39酶能夠水解ATP產生腺苷。CD39酶的非選擇性抑制劑，不僅可以增加ATP的促纖維化作用，還能夠增加促纖維化因子的合成。為了更好地闡明CD39在心肌纖維化中的作用，利用siRNA轉染技術沉默CD39基因可以增加細胞外ATP的濃度，增強ATP的促纖維化作用[9]。

CD73在多種細胞中表達，如免疫細胞、內皮細胞和間充質細胞，一般被認為能夠產生腺苷作用于A2AR[10]。CD73水解產生的腺苷通過調節中性粒細胞與內皮細胞黏附和轉運，在缺氧誘導的炎癥和免疫過程中發揮調節劑作用[11]。研究[12]顯示T細胞缺乏CD73對主動脈誘導的心力衰竭有一定的影響，進一步惡化心臟收縮功能，心肌纖維化增加，心肌成纖維細胞活化。心肌成纖維細胞活化能夠產生和分泌膠原蛋白，導致心肌細胞被纖維化瘢痕組織替代，從而出現纖維化。這些研究結果顯示心肌細胞內穩態和纖維化發生是體內ATP和腺苷協調的結果，其中腺苷抗纖維化作用受到酶CD39和CD73的調控。

2.3 CD39-腺苷能軸在肺纖維化中的作用肺纖維化是肺周圍的細胞組成發生改變和環境紊亂，膠原分泌增加，ECM過度積聚，最終導致肺功能出現喪失，是許多肺間質性疾病的誘因。腺苷作為信號分子是針對損傷而產生的，在損傷的早期能夠對其產生保護作用[13]，但是在疾病發展的慢性階段如肺纖維化等過程就會產生傷害[14]。CD39和CD73基因缺失能減少胞外腺苷的形成。

研究[15]顯示，機械性通氣能夠啟動先天免疫調節機制誘導CD39和CD73的表達，顯著增加肺組織中腺苷水平。腺苷通過減少內皮細胞的滲漏達到減輕機械性通氣造成肺損傷的目的。CD39/CD73基因缺失肺水腫和炎癥增加，誘導急性肺損傷加重。

但是在輻射照射誘導的模型中CD73基因缺失小鼠在肺泡間隔，膠原蛋白I、膠原蛋白III沉積，纖維化灶等肺纖維化現象中明顯輕于野生型小鼠，對肺纖維化起到保護作用[16]。此外，使用聚乙二醇腺苷脫氫酶或者CD73抗體治療全胸照射的野生型小鼠能夠顯著降低射線誘導的肺纖維化。Volmer et al[17]注射博來霉素可致小鼠體內膠原蛋白、組織纖維化增加以及促炎和促纖維化介質升高，而CD73基因敲除可以減少腺苷的積累，逆轉博來霉素誘導的肺纖維化。

這些結果顯示CD39-腺苷軸與肺纖維化具有一定相關性，調節CD39-腺苷軸中相關機制對治療肺纖維化有意義。

2.4 CD39-腺苷能軸在肝纖維化中的作用肝臟作為人體的主要解毒器官，其纖維化主要是由慢性肝損傷、肝炎等肝病過程演變導致的，其治療受到人們的廣泛關注。腺苷參與很多肝臟疾病，如肝臟缺血/再灌注損傷、肝癌和肝纖維化等。

2008年，Peng et al[18]研究發現CD73基因敲除可以減少CCl4處理的小鼠體內腺苷水平，降低肝纖維化發生，同時也指出抑制腺苷在胞外形成或阻斷腺苷受體有助于預防肝纖維化。同樣地，2010年有報道[19]證實CD73基因敲除在一定程度上能夠防止酒精性脂肪肝和內毒素引起的肝纖維化，A1R阻斷脂肪酸合成基因的表達，A2BR促進脂肪酸代謝基因的表達，靶向CD73基因和腺苷受體可以預防酒精誘導的脂肪肝。關于CD39在肝纖維化中的研究鮮有報道，有待進一步的研究。

2.5 CD39-腺苷能軸在腎纖維化中的作用腎纖維化是腎間質成纖維細胞活化、增殖以及遷移，促使ECM累積，腎結構發生變化，其病理表現主要是腎小球硬化、腎小管間質纖維化、炎癥浸潤以及腎實質喪失。其中腎小管間質纖維化可分為細胞活化和損傷、纖維化信號傳導、纖維化、腎損害4個階段[20]。已有文獻[21]證實，CD39依賴性產生的腺苷可以減少腎缺血再灌注損傷，減輕其向腎纖維化發展的趨勢。

CD73主要存在于管腔膜、小葉周圍成纖維細胞以及系膜細胞中，是腎臟細胞外腺苷的主要來源[22]。CD73水解產生的細胞外腺苷是參與腎小管-腎小球反饋的免疫調節劑，在大多數腎臟調節機制中起主導作用[23]。而CD73基因敲除導致腺苷的缺乏會破壞腎小球濾過屏障，增加腎纖維化的發生[24]。

2.6 CD39-腺苷能軸在其他器官纖維化中的作用胰腺星狀細胞是胰腺基質蛋白的主要生產者，參與胰腺纖維化的發展。胰腺星狀細胞的活化能夠刺激ECM合成，減少ECM降解，整體ECM積累[25]。ECM的積累是發生胰腺纖維化的關鍵因素。實驗中發現胰腺炎小鼠中胰腺星狀細胞高表達CD39，其中CD39基因缺失抑制實驗性胰腺炎中胰腺星狀細胞活化、增殖，前膠原蛋白α1表達以及胰腺纖維化。數據顯示細胞外腺苷調節胰腺星狀細胞的增殖和膠原的生成[26]。

最后，CD39在人體組織上皮細胞、炎癥細胞以及內皮細胞中表達，調節過量的核苷酸濃度，這可能與重建嘌呤信號通路調控囊性纖維化有關[27]。

3 小結與展望

纖維化疾病幾乎可以在人體的各個器官發生，其中肝、腎、心臟、肺、皮膚等器官或者組織中研究較多。纖維化是由慢性損傷造成的，是個緩慢的過程。現階段主要的研究除了器官移植外，還有基因治療、細胞治療、藥物治療等。但是由于器官移植存在供不應求的問題，所以滿足不了大部分患者的需求，導致很多患者得不到很好的治療。基因治療、細胞治療的方法主要是重組RNA或者修正離子運輸缺陷等，但是目前尚未導致可行的治療。因此不斷設計和合成新的靶點化合物，并通過結構優化提高藥物在體內的穩定性，達到更優的治療效果，將具有更大的治療前景。

上面的研究顯示腺苷及其受體亞型在調節纖維化疾病方面所發揮的作用有差異。作為水解細胞外ATP為腺苷的胞外酶，CD39和CD73不論是動物還是人體中都廣泛存在并且發揮著必不可少的作用。近年來，隨著CD39和CD73在各種疾病中的研究，比如器官缺血再灌注損傷、免疫炎癥、纖維化以及腫瘤癌癥等方面，人們開始越來越多地認識到了胞外酶CD39和CD73在水解產生腺苷中的重要性。

纖維化疾病是在慢性損傷中逐漸形成的，假如在炎癥損傷初期就對腺苷水平進行調控，那么就能夠有效地預防纖維化疾病的發生。正如本文中所討論的，越來越多CD39-腺苷軸上的分子和信號通路介質可用來開發治療纖維化疾病的藥物。然而，關于CD39-腺苷軸仍然有許多重要的問題束之高閣，比如關于CD39和CD73在纖維化疾病中參與組織重塑的機制。另外，正如上面所描述的實驗中，腺苷作為分子信號，既能產生保護作用又能產生損傷作用，那么組織損傷或者疾病階段經CD39和CD73介導產生的腺苷到底是產生有利還是不利的影響還需要進一步的研究。最后，關于該軸的研究大部分都尚處于基礎動物研究階段，如何將基礎動物研究成果實化為具體藥物應用到治療臨床疾病上，仍然有很長的一段路需要摸索。因此，需要更多的實驗研究闡明CD39-腺苷軸的作用機制，為纖維化疾病的治療提供更多的藥物靶點和治療手段。