人參果漿中人參皂苷Re的提取和生物轉化

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(1.大連工業大學生物工程學院,遼寧大連 116034;2.大連大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116622)

人參(PanaxginsengC.A.Mayer)是傳統的名貴中藥,通常入藥部位是人參根部(地下部位),莖葉、花蕾以及果實等,地上部位的利用還欠缺,有待于進一步開發。人參中主要活性成分是三萜類人參皂苷,廣泛存在于人參屬植物的根、莖葉、花蕾以及果實中[1-2]。迄今為止,人們所熟知的人參皂苷多達60多種[1-2]。但是,人參中含量高的Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re等原型皂苷,由于帶多個糖基,生理活性和生物利用度都較低,口服后在腸道中可以轉化為低糖基的稀有皂苷,例如C-K,經腸道吸收后起藥效。研究表明,人參原型皂苷在腸道中的轉化非常微弱,大部分很難被利用[3-5]。而低糖基的人參皂苷Rg2、C-K、Rg3、Rh2、Rh1等,在腸道中的吸收率高[3-5],具有抗癌、抗血栓、抗炎癥、抗皮膚老化以及治療神經系統疾病的功效。其中人參皂苷Rg2具有強心作用,可用于治療失血性休克、心源性休克等疾病[6-7],對醫藥、保健食品、化妝品的研發有重要意義[8-11]。

目前,在我國現有條件下,種植四年以上的人參果一般用于取人參籽作為人參種子,剩余的人參果漿少部分用于人參果酒、飲料等的制作,大部分廢棄,總體利用率很低。人參果漿中人參皂苷Re的含量很高[2,12],但Re屬于人參原型皂苷,分子結構中的6-O-位置帶有2個糖基、20-O-位置帶有1個糖基,共三個糖基,分子量較大,生理活性和生物利用度偏低[3-4]。關于將Re等三醇類人參皂苷,轉化為高活性、低糖基的人參稀有皂苷方面的研究,本實驗室曾報道過人參皂苷酶4型水解法[13]以及Rg2組四種異構體的分離方法[14],可以有效實現人參原型皂苷向人參稀有皂苷的轉化;李亨等將復合菌(枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉)加入到人參須粉末培養基中,60 ℃發酵培養10 d,轉化制備得到Rg2[15]。包海鷹等采用黑根霉Rhizopussp,在其菌種發酵中加入人參皂苷Re,從發酵產物中制備得到人參皂苷Rg2,得率為10.1%[16]。

為了充分利用人參加工廠廢棄的果漿,本文實地考察了吉林撫松地區的人參地,采集了新鮮的人參果實,分析其組成成分;收集了當地人參加工廠廢棄的人參果漿,并將其噴霧干燥制成干品,對干品進行組成成分分析,提取其中的人參皂苷Re,并以Re為底物生物轉化為人參皂苷Rg2組(包含20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6),此為人參加工廠廢棄果漿的綜合利用提供了理論依據,為人參皂苷Re提取與轉化的工業化生產提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參果實 4年生,8月初到吉林省撫松參地采摘;人參果漿干粉 取撫松人參加工廠去籽后的果漿,噴霧干燥得到的干粉;人參皂苷對照品Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20(S)-Rg2、20(R)-Rg2 由天津天宿光華健康科技公司提供;AB-8大孔吸附樹脂、D-280離子交換樹脂 天津南開大學試劑生產;薄層層析板Silica gel 60-F254 德國Merck公司;乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純) Tedia公司。

高效液相色譜系統2695,配有2996二極管陣列檢測器及Empower色譜工作站 美國Waters公司;超高效液相-四級桿飛行時間串聯質譜聯用儀(UHPLC-H-CLASS/XEVO G2-XS Q-TOF),配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur4.1數據處理系統 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參果實中人參籽和人參果肉及水分占比測定 取一定量的新鮮人參果實稱重,于60 ℃烘箱內烘干至恒重、稱重,可計算出水分含量。將烘干的人參果實加蒸餾水浸泡、搗碎、分離人參籽和果漿,分別烘干至恒重、稱重,得到人參籽和人參果實的果肉質量。

1.2.2 人參果漿中總皂苷的提取 于60 ℃條件下,分別取1.2.1干燥后的人參果實干粉和收集于人參加工廠經噴霧干燥得到的人參果漿干粉10 g,加入100 mL 75%(V/V)乙醇、攪拌均勻,提取48 h,分離上清液,重復三次;合并上清,減壓濃縮至30 mL,石油醚脫脂,加入預先處理好的柱體積為30 mL的AB-8柱、反復上樣,直到皂苷被完全吸附,用240 mL去離子水洗脫糖類等雜質,以180 mL 84%(V/V)乙醇洗脫皂苷[17]。洗脫液再經柱體積為30 mL的D-280脫色樹脂柱脫色[18],再減壓濃縮至30 mL,于50 ℃烘箱中恒溫干燥得到皂苷干品,并采用HPLC法測定總皂苷的組成。

1.2.3 人參皂苷Re的提取 于60 ℃條件下,取1000 g人參果漿干粉,加入10000 mL 75%(V/V)乙醇、攪拌均勻,提取48 h,分離上清液,重復3次,合并上清,減壓濃縮至3000～5000 mL,加入預先處理好的柱體積為3000 mL的AB-8柱、反復上樣,直到皂苷被完全吸附,用24000 mL去離子水洗脫糖類等雜質,18000 mL的84%(V/V)乙醇洗脫皂苷[17]。洗脫液再經柱體積為3000 mL的D-280脫色樹脂柱脫色[18],再減壓濃縮至3000 mL,濃縮液靜置20 h,經結晶、過濾后(濾液回收待用),于50 ℃烘箱中恒溫干燥得到人參皂苷Re,并采用HPLC法進行檢測,計算其純度。

1.2.4 人參皂苷Re的生物轉化 本研究采用人參自身酶的粗酶液,將人參皂苷Re轉化為人參稀有皂苷Rg2組。

1.2.4.1 人參自身酶粗酶液的提取 選取新鮮的人參根,提取皂苷,取剩余的人參根殘渣10 g,加入800 mL去離子水,在75 ℃條件下提取6 h,重復3次,合并提取液,減壓濃縮至60°Bé,離心除渣,在室溫下設定轉速為8000 r/min,時間是15 min,得到200 mL人參自身酶的粗酶液[19-20]。

1.2.4.2 人參皂苷Rg2組的制備 取10 g人參皂苷Re,加入20 mL上述人參自身酶的粗酶液,再加入20 mL乳酸,60 mL去離子水,在70 ℃條件下反應2 h[19-20]。反應結束后,用600 mL去離子水稀釋,以200 mL的大孔樹脂柱吸附皂苷,反復上樣,直到皂苷全部被樹脂吸附,用水洗凈渣滓,再用800 mL的70%(V/V)乙醇洗脫,減壓濃縮后,于50 ℃烘箱中恒溫干燥[17],得到人參皂苷Rg2組,并采用HPLC法對人參皂苷Rg2組的組成進行分析。

1.2.5 皂苷組成分析

1.2.5.1 皂苷樣品的制備 精密稱取人參皂苷對照品Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、人參果漿中提取的人參總皂苷、分離純化后的人參皂苷Re和生物轉化得到的人參皂苷Rg2組樣品各2 mg,溶于1 mL色譜甲醇中,經0.22 μm濾膜過濾,待測。

1.2.5.2 高效液相色譜(HPLC)分析 采用高效液相色譜分析儀,二極管陣列檢測器。色譜條件:Knauer C18色譜柱(5 μm,Φ 4.6 mm×250 mm);流動相為乙腈(A)-水(B):0～20 min,20% A等度;20～31 min,20% A～32% A線性梯度;31～40 min,32% A～43% A線性梯度;40～70 min,43% A～100% A線性梯度。進樣量10 μL;柱溫35 ℃;流速1 mL/min;檢測波長203 nm[21]。

1.2.5.3 對照品溶液的制備及線性關系考察 精密稱取人參皂苷Re對照品4 mg溶于2 mL色譜甲醇中,配成濃度為2 mg/mL的對照品溶液。取對照品溶液加入色譜甲醇,分別稀釋成濃度為1.5、1.0、0.5、0.25 mg/mL的對照品溶液,經0.22 μm濾膜過濾,待測。分別取上述制備的不同濃度對照品溶液按1.2.5.2的色譜條件進樣分析,以測得的峰面積為Y軸對照品濃度為X軸繪制標準曲線,用最小二乘法進行線性回歸[22],得到人參皂苷Re的回歸方程:y=636672x-115207(R2=0.9992)。

人參皂苷Re的定量計算

式(1)

式中，Re表示人參皂苷Re的質量百分比,%;A:表示樣品中人參皂苷Re的峰面積;W樣:表示樣品的濃度,mg/mL。

圖2 人參皂苷的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of ginsenosides注:a.人參皂苷對照品;b.人參果漿干粉中的人參總皂苷。

1.2.5.4 超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜(UPLC-Q-TOF-MS)分析 色譜條件:BEH shield RP18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,Waters);流動相為(A)0.1%甲酸-乙腈、(B)0.1%甲酸-水;梯度洗脫:0～5 min,5% A～95% A線性梯度,5～10 min,95% A等度;進樣量10 μL;流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃。質譜條件:電噴霧離子化源(ESI),負離子檢測模式,毛細管電壓2.5 kV;樣品孔電壓35 V;離子源溫度100 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;錐孔氣流速50 L/hr,脫溶劑氣流速1000 L/hr;質量掃描范圍m/z 100-1000。

1.3 數據處理

超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜法(UPLC-Q-TOF-MS)數據分析采用Xcalibur4.1數據處理系統采集、處理數據,Microsoft Excel 2003統計分析。

2 結果與分析

2.1 人參果漿中皂苷組成分析

2.1.1 人參果實中籽、果肉以及水分的占比 實驗發現,36.3 g人參果實的干重為12.11 g,水分含量為66.63%(W/W);人參籽的重量為9.86 g,果肉的重量2.15 g,分別占人參果實干重的82.09%(W/W)、17.90%(W/W)。

2.1.2 人參果漿中總皂苷的提取 以實驗方法1.2.2提取總皂苷,干燥后的人參果漿干粉和收集于人參加工廠經噴霧干燥得到的人參果實干粉總皂苷含量分別為6.93%、6.21%(W/W)。由此可見,人參果漿干品中的總皂苷含量與上述實驗室測得的新鮮人參果實果肉干品中的總皂苷含量相近,人參加工廠中人參果的去籽處理過程,損失的皂苷相對較少,以下實驗將以收集于人參加工廠經噴霧干燥得到的人參果漿干粉為研究對象。

對人參果漿干品中制備得到的人參總皂苷,采用HPLC方法測定其皂苷組成,結果如圖2b所示。

通過與人參皂苷Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd對照品的保留時間比對,可以確定人參果漿制備的人參總皂苷主要含有Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd五種皂苷,并采用式(1)計算得到其中人參皂苷Re的含量為55.1%(W/W)。由此得知,人參果漿是提取Re的理想原料。

2.2 人參皂苷Re的分離純化

1.2.3制備得到的人參皂苷Re HPLC檢測圖譜如圖3所示。圖3中純化得到的人參皂苷Re,采用式(1)計算得到純度為90%(W/W)。將1.2.3中回收的濾液再減壓濃縮至2000 mL,冷卻結晶,重復2 次,干燥后共得到14 g,經HPLC檢測純度為80%(W/W)。綜上,從1000 g人參果漿干粉中共得到24 g不同純度的人參皂苷Re得率約為2.4%(W/W)。

圖3 人參果漿干粉中人參皂苷Re的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of ginsenoside Re in dry powder of ginseng fruit pulp

2.3 人參皂苷Rg2組的組成分析

人參根中含有人參皂苷酶,作用于人參皂苷Re可以發生生物轉化,將其轉化為Rg2組,按照實驗方法1.2.4.2生物轉化制備得到6.5 g的人參皂苷Rg2組,得率為65%(W/W)。對產物人參皂苷Rg2組進行HPLC分析,結果如圖4所示。

圖4 人參皂苷Rg2組的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of ginsenosides Rg2 group

由圖4中可知,Rg2組中含有四種人參皂苷,通過與上述圖2a人參皂苷對照品保留時間的比對,初步判斷含有人參皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2,另外兩種未知皂苷初步判斷為Rg4、Rg6,四種皂苷保留時間(min)依次為39.650、40.029、47.005、47.657 min。

圖6 20(S)-Rg2(a),20(R)-Rg2(b)在ESI負離子模式下的一級質譜圖Fig.6 MS of 20(S)-Rg2 and 20(R)-Rg2 in ESI negative ion mode

2.4 超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜(UPLC-Q-TOF-MS)驗證Rg2組中四種異構體

1.2.4.2制備的Rg2組樣品,采用UPLC-Q-TOF-MS,分別在ESI源的正、負離子模式下檢測,樣品的總離子流圖如圖5所示。

圖5 Rg2組樣品總離子流圖譜Fig.5 Total ion chromatogram of Rg2 group注:a.ESI正模式下Rg2組;b.ESI負模式下Rg2組。

從圖5中可以看出,ESI正、負離子模式下總離子流圖中的20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4、Rg6的保留時間(min)依次為2.89、2.93、3.52、3.59 min,與UPLC檢測圖譜中各組分、標準品的保留時間相匹配,證明Rg2組確系含有的四種異構體組分。ESI正、負離子模式下總離子流圖比較發現,負離子模式下Rg2組檢測的干擾性較小,且靈敏度較高,因此選擇負離子模式進行分析檢測。

圖7 Rg4(a)、Rg6(b)在ESI負離子模式下的一級質譜圖Fig.7 MS of Rg4 and Rg6 in ESI negative ion mode

圖8 Rg2組中四種異構體皂苷的化學結構Fig.8 Chemical structures of four ginsenoside isomers in Rg2 group

首先對Rg2組人參稀有皂苷中20(S)-Rg2、20(R)-Rg2的離子峰在ESI負離子模式下進行一級質譜分析,結果如圖6所示。

從圖6a中可以看出,保留時間2.89 min出現的m/z 829和m/z 783分別是[Rg2-H+HCOOH]-和[Rg2-H]-峰,得出其相對分子量為784,與文獻比對確認其為20(S)-Rg2[23]。同理,由圖6b分析出其手性異構體20(R)-Rg2,相對分子量也是784。

從圖7a和圖7b中可以看出,保留時間3.52和3.57 min出現的[M-H+HCOOH]-和[M-H]-峰均相同,分別是m/z 811和m/z 765,表明兩種化合物的分子量均為766,經與參考文獻比對定性為Rg6和Rg4[24]。

綜上,Rg2組中含有四種異構體人參稀有皂苷:分子量為784的20(S)-Rg2和20(R)-Rg2,分子量為766的Rg4和Rg6,其結構圖如圖8所示。

3 討論與結論

人參加工廠在人參果實取籽后,殘余的果漿大部分被廢棄。本研究發現廢棄的人參果漿中還富含人參皂苷Re,含量高達55.1%(W/W)。可以利用廢棄的人參果漿,分離提取人參皂苷Re,再經生物轉化進一步制備高附加值的20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6等稀有皂苷。人參皂苷20(S)-Rg2和20(R)-Rg2有抗神經毒性和增強記憶的功能,且在體內和體外均有顯著的促進腺苷酸活化蛋白激酶的作用,可以抑制脂肪的生成[25];還具有抗抑郁、緩解創傷后應激障礙的作用[26];與蝦青素聯合作用可以上調脫氧核糖核酸水平以此來降低細胞毒性和遺傳毒性[27];能減輕缺血時心肌細胞線粒體的損傷,對急性心源性休克犬心肌細胞線粒體具有一定的保護作用[28]。Rg6對人體淋巴細胞瘤的生長有抑制和誘導凋亡的作用[29]。Rg4對顆粒物誘導的炎癥性肺損傷和血管通透性增高具有保護作用[30]。

本研究利用廢棄人參果漿生產人參稀有皂苷,生物轉化產物為Rg2組,由20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6等異構體皂苷組成,產率達到65%(W/W),為廢棄人參果漿的綜合利用提供理論依據,也為醫藥、保健食品、化妝品的研發,提供了新的原料生產途徑。