藍莓添加對柿子果酒抗氧化及風味物質的影響

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

柿子(DiosproskakiL.)屬柿科柿屬,多年生落葉果樹,主要生長在亞熱帶和中溫地區[1]。作為柿子生產大國,我國柿子的產量和種植面積均居世界首位,而河南省柿子的栽培面積和產量均占全國第3位,是三大產區之一[2-3]。柿子中富含類胡蘿卜素、礦物質、多酚類、糖類、維生素等營養物質,具有藥用價值和經濟價值,在近年來日益受到市場的青睞[4]。然而相較于我國的柿子產量,其柿子加工利用率由于生產加工方式的落后而遠遠低于歐美等發達國家[5]。在柿子的采收、運輸、加工過程中都會有大量副產物的出現,這些副產物無法得到有效利用,造成資源浪費和經濟損失,也會對環境造成影響。如何有效利用柿子資源,對其進行深加工已成為當前我國柿子產業上一個不可回避的突出問題。

隨著柿子藥用功效的進一步開放及加工技術的改進和完善,將柿子加工成的柿子果酒具有較高的保健價值和營養價值[6-7]。然而由于柿子含有大量的單寧和果膠物質,且缺少葡萄、藍莓等果實中所具有的各種有機酸,使其釀成的柿子果酒酒體平淡、不穩定、酸澀、香味寡淡且口感較差[8-10]。藍莓(Vacciniumspp.)又名越桔,是我國北方地區特有的一種營養豐富的深藍色漿果[11]。藍莓中不僅富含花青素、維生素和微量元素等營養物質,具有強抗氧化性、抗癌、增加機體免疫力等功能[12-13];同時還含有各種有機酸,經微生物發酵,其具有獨特的風味、酯香醇厚的果酒香氣而深受國內外消費者的青睞[14]。因此將藍莓添加到柿子果酒的釀造中,可彌補柿子果酒的缺陷,同時兼有兩者的營養與口感。但目前鮮少見到有關藍莓添加改善柿子果酒抗氧化及風味特性的報道。

本研究利用添加藍莓對柿子進行發酵,通過比較柿子-藍莓果酒與柿子果酒發酵期間理化指標、總酚含量及抗氧化能力的變化趨勢,并研究了風味物質種類和含量的變化,來判定藍莓添加對柿子果酒發酵的影響,以期彌補柿子果酒缺陷的同時提高營養保健價值,為開發利用柿子和藍莓資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水柿 采摘于河南省輝縣市;藍莓 購自南京茅峰農業科技有限公司;活性干酵母EC 1118 購自丹麥LALVIN;果膠酶RCO(25000 PGU2/mg) 購自上海鼎唐國際貿易有限公司;福林酚試劑 購自北京索萊寶科技有限公司;總抗氧化試劑盒 購自南京建成科技有限公司;2-辛醇、沒食子酸、乙酸甲酯、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-糠醛、乙酸、異丁酸、辛酸、己酸乙酯等標品(純度≥98%) 購自Sigma-Aldrich;其他分析純試劑 均購自天津科密歐化學試劑有限公司。

UV-2000型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;恒溫振蕩培養箱 福瑪(上海)實驗設備有限公司;GC-MS Trace Dsq GC-MS-Finnigan(美國)公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、手動SPME進樣器 Supelco(美國)公司;DB-WAX彈性石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) Agilent(美國)公司;cp2245 型分析天平 Sartorius(德國)公司;HH恒溫水浴鍋 科偉永興(北京)儀器有限公司;Y88破壁機 九陽(山東)股份有限公司;pH計 精密科學儀器(上海)有限公司;R-120型旋轉蒸發器 BüCHI(瑞士)公司;低溫離心機 中科中佳(安徽)科學儀器有限公司;手持糖度儀 泉州光學(福建)儀器廠;酒精度計 釀哥釀酒(廣東)設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柿子果酒的釀造工藝 柿子-藍莓果酒中柿子汁與藍莓汁比例為2∶1 (V/V)。

操作要點:選取成熟豐滿的新鮮柿子,洗凈瀝干水分后,用75%酒精均勻噴灑后,密封存放24 h脫澀;柿子破壁打漿時同步加入0.4%的VC(防止氧化)和1/6的水,制備成柿子汁;按照柿子汁體積的一半加入藍莓原汁(采用破壁機打汁),采用巴氏殺菌除去雜菌,操作條件為70 ℃保溫30 min;向制備好的柿子-藍莓汁或柿子汁中添加其重量0.2%的果膠酶,pH自然(柿子-藍莓酶解液pH為3.6,柿子酶解液為4.01),50 ℃下酶解3 h,以促進果膠降解;加入0.1%的明膠水溶液,50 ℃下放置24 h后經四層紗布過濾得到果汁;測定柿子果汁和柿子-藍莓果汁的糖度,并加入白砂糖至糖度為17～18;接種酵母時,利用少量柿子果汁或柿子-藍莓果汁溶解酵母干粉,于28 ℃下培養2 h后接入相應果汁中進行酒精發酵,加入焦亞硫酸鉀,其加入量以SO2含量計為50 mg/L,溫度25 ℃,主發酵14 d[15]后,過濾除渣,酒液在4 ℃條件下陳釀兩個月,制得果酒。分別測定0、2、4、6、8、10、12、14 d的理化指標、總酚含量及抗氧化特性,測定所制果酒的酒精度、微生物含量、感官評價和風味物質。

1.2.2 理化指標的測定 pH:pH計法測定;可溶性固形物(Total Soluble Solid,TSS):利用手持糖度計測定;酒精度:參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[16]利用酒精度計測定;滴定酸:參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[16]中的NaOH中和滴定法測定;還原糖:參照李軍鵬等[17]的方法,采用DNS比色法測定。

1.2.3 微生物檢測 參照GB/T 4789.25-2003《食品衛生微生物學檢驗 酒類檢驗》[18]測定菌落總數,并檢測有無金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和沙門氏菌。

1.2.4 感官評價 參照15038-2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法》[16]對原酒的色澤、香味和口感進行感官評價。

1.2.5 總酚含量的測定 參照Ubeda等[19]的方法,以沒食子酸標品作標準曲線,將發酵液中總酚含量換算為沒食子酸含量,單位為g/L(以沒食子酸計)，得到標曲方程為y=0.0122x+0.004(R2=0.9998)。

1.2.6 抗氧化能力的測定 超氧陰離子清除率參照Beltrame等[20]的方法進行測定;DPPH·清除率參照Barba等[21]的研究方法進行測定;OH·清除率參照Beltrame等[20]的研究方法進行測定;鐵離子還原能力參照朱明明等[22]的方法進行測定。

1.2.7 風味物質測定 參考Zhu等[23]的方法采用頂空-固相微萃取(HS-SPME)提取釀造果酒中的揮發性物質。先用無水乙醇將2-辛醇內標稀釋至濃度為0.166 mg/L,向5 mL果酒中加入5 μL稀釋好的內標,并置于15 mL固相微萃取專用瓶中,同時加入1 g NaCl充分溶解后,隔膜封口。將樣品瓶放入50 ℃水浴鍋中,將老化好的固相微萃取頭(DVB/CAR/PDMS萃取頭在氣相色譜儀的進樣口250 ℃老化1 h)插入樣品瓶,距離液面1 cm。在此條件下吸附40 min后,將萃取頭迅速拔出并插入氣相色譜儀進樣口,250 ℃熱解析5 min。

圖1 柿子-藍莓果酒和柿子果酒釀造過程中品質指標的變化Fig.1 Changes of quality indexes during the fermentation of persimmon-blueberry wine and persimmon wine注:pH(A)、TSS(B)、滴定酸(C)和還原糖含量(D)。

GC條件:手動無分流進樣,進樣口250 ℃,升溫程序:40 ℃,1 min;3 ℃/min升溫至150 ℃;10 ℃/min升溫至220 ℃;220 ℃,1 min。檢測器溫度250 ℃,載氣為氦氣,1 mL/min。

MS條件:電離方式EI,離子能量70 eV;接口溫度280 ℃;離子源250 ℃;質量掃描范圍:30～450 amu。

香氣標準品的配制及測定:采用無水乙醇分別將2-辛醇內標和乙酸甲酯、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-糠醛、乙酸、異丁酸、辛酸、己酸乙酯等標品稀釋。隨后各取4 μL混合均勻,溶解于10 mL的6%乙醇溶液中,HS-SPME法萃取揮發性物質并利用GC-MS進行解析,從而計算得到標準化合物與內標間的響應因子,響應因子=(標準品濃度/標準品峰面積)/(內標濃度/內標峰面積)[24]。

定性及定量分析:利用隨機Xcalibur工作站的標準譜庫自動檢索各組分質譜數據,并利用已有標品的標準圖譜對機檢結果進行確認,最終確定香氣成分;根據所得響應因子計算香氣化合物濃度,確立其計算公式為:香氣化合物濃度=(香氣物質峰面積/內標峰面積)×內標濃度×響應因子。而對于沒有對應標品的香氣物質采用結構相似的標品進行計算[24]。

1.3 數據處理

以上所有試驗均為三次平行,取平均值。使用SPSS 18.0軟件進行方差分析,方差顯著性分析用Duncan multiple-range test進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 藍莓添加對釀造過程中理化指標變化的影響

采用柿子-藍莓和柿子釀造果酒,其發酵液理化指標的變化結果如圖1和表1所示。由圖1可知,柿子-藍莓果酒和柿子果酒在釀造過程中pH、可溶性固形物(TSS)和還原糖的總體變化趨勢基本一致。發酵前,柿子醪液的pH為4.03,TSS為18%,滴定酸為6.60 g/L(以酒石酸計),還原糖含量為165.39 g/L(以葡萄糖計),而藍莓汁的加入,導致醪液酸度增加、糖度降低。其中pH降低為3.6,TSS和滴定酸變化不大,分別為17.50%和6.80 g/L(以酒石酸計),還原糖含量降低,為149.88 g/L(以葡萄糖計)。與發酵前相比,發酵后(14 d)柿子-藍莓和柿子果酒的pH、可溶性固形物(TSS)和還原糖含量均顯著下降(P<0.05),而柿子-藍莓和柿子果酒的滴定酸含量為6.45和6.35 g/L(以酒石酸計),與初始的醪液無顯著差異(P>0.05)。在發酵初期,兩種果酒的滴定酸含量均有顯著(P<0.05)升高,隨后緩慢降低,尤其是柿子-藍莓果酒,與pH下降相一致,這可能是由于藍莓釋放大量有機酸而提高果酒的滴定酸含量[14]。

表1 發酵果酒的其他指標Table 1 Other indicators of fermented wine

由圖1和表1可知,酒精發酵結束后柿子-藍莓和柿子果酒的殘糖量為2.60和2.88 g/L,酒精度均為8%vol,表明達到干酒要求(殘糖量低于4.00 g/L)[22]。

另外,檢測了果酒中的微生物指標(表1),柿子-藍莓果酒和柿子果酒菌落總數為38.06和45.37 CFU/mL,低于50.00 CFU/mL,均未檢出金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌等致病菌,符合標準要求[18]。通過對果酒進行感官評定,結果表明添加了藍莓的柿子果酒酒體更加清澈,顏色呈暗紅色,這主要是由于藍莓中富含花青素等多酚類衍生物,其香味也更加濃厚。上述結果說明,添加藍莓對柿子酒的品質影響不大,在提高其色澤風味的同時,確保適口性和安全性。

2.2 藍莓添加對釀造過程中總酚含量的影響

如圖2所示,柿子-藍莓果酒和柿子果酒在釀造過程中,其總酚含量呈現出先上升后下降并趨于平緩的趨勢。預實驗結果表明藍莓的總酚含量(0.44 g/L，以沒食子酸計)要顯著高于柿子(0.36 g/L，以沒食子酸計),而發酵前(0 d),柿子-藍莓醪液和柿子醪液的總酚含量無顯著差異(P>0.05),這主要是由于前者中藍莓果汁含量較低造成的;兩種果酒均在第2 d總酚含量達到最高,這可能是由于發酵初期,果汁中的多酚釋放,增加了總酚含量,其中柿子-藍莓果酒總酚含量顯著高于柿子果酒,原因可能是藍莓中富含花青素,在發酵過程中釋放出來,增加總酚含量[25](P<0.05);而后由于多酚部分氧化,造成含量呈現下降趨勢。發酵結束時,柿子果酒總酚含量相較醪液呈現下降趨勢,含量為0.29 g/L(以沒食子酸計),這與馬琳等[26]的實驗結果一致;而柿子-藍莓果酒中總酚含量(0.45 g/L)高于醪液水平(0.39 g/L),表明藍莓的添加可提高柿子果酒釀造過程中總酚的含量并對其釋放有一定的促進作用。

圖2 柿子-藍莓果酒和柿子果酒釀造過程中總酚含量的變化Fig.2 Changes of total polyphenol contents during the main fermentation of persimmon-blueberry wine and persimmon wine

2.3 藍莓添加對釀造過程中抗氧化能力的影響

如圖3，發酵前,柿子醪液超氧陰離子清除率為66.58%,DPPH·清除率為88.75%,OH·清除率為28.90%,鐵離子還原能力為96.05%；柿子-藍莓醪液的抗氧化指標分別為67.56%、87.35%、30.20%、95.80%,與柿子醪液無顯著差異(P>0.05)。由圖3A可知,柿子果酒在釀造2 d時,超氧陰離子清除率達到最高,為68.68%,2 d后緩慢下降并趨于平緩,發酵結束時,其超氧陰離子清除率為61.00%,顯著低于初始水平(P<0.05)。柿子-藍莓果酒超氧陰離子清除率也在第2 d時達到最高,隨后緩慢下降并趨于平緩,但發酵結束后超氧陰離子清除率顯著高于初始水平,為70.83%(P<0.05),表明藍莓的添加可增強果酒的超氧陰離子清除能力,這與總酚含量的變化一致。

如圖3B所示,柿子-藍莓醪液經發酵后(14 d)DPPH·清除能力顯著提高(P<0.05),表明柿子和藍莓果是比較強的自由基淬滅劑。兩種果酒釀造過程中DPPH·清除能力總體均隨時間先上升,2 d時達到最大,而后下降,再上升并趨于平緩,分析原因可能是由于其中含有的多酚類化合物具有較強的清除DPPH·自由基的能力[22],與總酚第2 d達到最大相一致。發酵結束時,柿子-藍莓果酒和柿子果酒的DPPH·清除率為95.00%和95.45%,兩者無顯著差異(P>0.05),可能是由于柿子果酒中某種多酚類物質具有超強的清除DPPH·自由基能力。

柿子-藍莓和柿子在發酵初期,OH·清除能力的變化趨勢一致(圖3C)。同樣地,在2 d時達到最大,隨后降低,第8 d時達到最低值。而在發酵后期,柿子-藍莓果酒的OH·清除能力出現先上升后下降,再略微上升的趨勢;柿子果酒則先上升后緩慢下降,這可能是由于柿子和藍莓中多酚含量及組成成分不同,在發酵過程中多酚組分會發生不同的變化。總體上,經發酵后柿子-藍莓果酒和柿子果酒的OH·清除率分別為27.34%和24.45%,較初始值均有顯著下降(P<0.05)。一方面可能是由于隨著酒精度含量的持續升高,導致多酚聚合度發生變化,總酚含量降低,導致清除OH·自由基能力下降,另一方面認為糖苷的取代位置不同,對抗氧化性也有影響,糖苷基的引入會造成抗氧化能力的降低[27];但柿子-藍莓果酒的OH·清除率高于柿子果酒(P<0.05),也表明藍莓添加提高了果酒的OH·清除能力。

如圖3D所示,柿子-藍莓和柿子果酒的鐵離子還原能力隨時間變化趨勢一致,均先上升后下降。發酵結束時,兩種果酒的還原能力接近,分別為87.78%和86.95%,顯著低于初始值(P<0.05),表明發酵降低了兩種果酒的鐵離子還原能力。

圖3 柿子-藍莓果酒和柿子果酒抗氧化能力指標Fig.3 Antioxidant ability indexes of fermented persimmon-blueberry wine and persimmon wine注:超氧陰離子(A)、DPPH·(B)、OH·(C)清除率和還原能力(D)。

以上結果表明,與柿子果酒相比,藍莓的添加可提高果酒對超氧陰離子、DPPH·和OH·自由基的清除能力,使柿子-藍莓果酒表現出更強的抗氧化能力。另外,發酵過程中上述抗氧化指標的變化并不完全與總酚含量的變化相一致,這主要是由于抗氧化能力不僅與總酚含量有關,而且與多酚的組成密切相關[22]。目前,有關具體的多酚組成及酚類物質的分別作用仍在進一步研究中,以期揭示抗氧化增強的機理。

表2 柿子-藍莓果酒和柿子果酒的主要風味物質Table 2 Analysis of flavor components in persimmon-blueberry wine and persimmon wine

續表

2.4 藍莓添加對釀造過程中風味物質的影響

發酵14 d后的柿子-藍莓果酒和柿子果酒經頂空固相微萃取-氣質聯用(HS-SPME-GC-MS)分析后得到主要的風味物質,其相對含量對比結果見表2。柿子-藍莓果酒揮發性成分的種類和含量明顯高于柿子果酒。經與標準譜庫匹配比對,柿子-藍莓果酒共檢測出39種揮發性成分,主要包括醇類17種,酯類10種,酸類5種,醛酮類1種,呋喃類3種,其他化合物共3種。而柿子果酒共檢出28種揮發性成分,其中醇類11種,酯類8種,酸類6種,呋喃類1種,其他化合物2種。

已有研究表明,酯類是果酒香型的特征性成分,可使酒體柔和、香氣豐滿;醇類次之,高級醇的存在不僅賦予果酒優雅的香氣,同時可溶解其他香氣物質,對香氣形成有重要的提攜作用;酸類物質則有助于改善果酒的利口性;其他的酮類及烷烴類等成分在香氣成型過程中也有不可忽視的作用[9,28]。由表2可知,經發酵后柿子果酒中的乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、己酸、辛酸含量較高。劉曉艷等[29]的研究結果表明,柿子果酒的主要香氣成分為異戊醇和苯乙醇,其中苯乙醇因具玫瑰香氣和蜜香而成為構成柿子果酒特征香氣的主要成分。乙酸乙酯則被公認為對果酒香型影響最大的化合物,而辛酸乙酯具橙子果香和玫瑰花香、苯乙酸乙酯具濃烈而甜的蜂蜜香氣,從而賦予果酒特殊的香味[30]。本研究發現,柿子-藍莓果酒中異戊醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸和辛酸含量顯著高于柿子果酒(P<0.05)。柿子-藍莓果酒中未檢測出3-甲基-1-丁醇乙酸酯、2-甲基己酸、4-溴苯并環丁烯,但檢測到含量較高的芳樟醇、α-松油醇、4-乙酸松油酯、香葉基丙酮、2-呋喃甲酸乙酯和1,5,5-三甲基-6-亞甲基-環己烯等揮發性成分。其中芳樟醇具有鈴蘭香氣,是目前最常用的香料之一[31];α-松油醇具有紫丁香味[32];4-乙酸松油酯具檸檬果香和薰衣草香[33];香葉基丙酮具木蘭香,略帶甜蜜-玫瑰香韻,使得柿子-藍莓果酒香氣更加豐滿[34]。前期研究發現,柿子-藍莓果汁中共檢測出香氣成分14種,而上述含量較高的揮發性物質均未在果汁中檢測到。總體上,藍莓-柿子果酒的酯類化合物總含量為147.45 μg/L,與柿子果酒相當(147.93 μg/L),而前者的醇類、酸類、呋喃類及其他類風味物質總含量分別為643.03、97.87、8.15和3.09 μg/L,均顯著高于柿子果酒中這些風味物質含量(602.54、90.32、1.45和2.13 μg/L)(P<0.05)。上述結果表明,藍莓添加后,可促使發酵過程產生更多的香氣物質,豐滿果酒的香氣,彌補柿子果酒香味寡淡的缺陷,改善果酒風味。

3 結論

本文考察了藍莓的添加對柿子果酒理化特性、抗氧化性及風味的影響。結果表明,相較于柿子果酒,藍莓的添加雖然導致醪液酸度增加、糖度降低,但各項理化指標符合果酒要求,且無致病菌檢出;藍莓的添加可提高柿子果酒釀造過程中總酚的含量并對其釋放有一定的促進作用;也可增強果酒對超氧陰離子、DPPH·和OH·自由基的清除能力,使柿子-藍莓果酒表現出更強的抗氧化能力;柿子-藍莓果酒種有39種揮發性成分,遠高于柿子果酒成分種類(27種),其醇類、酸類、呋喃類及其他類風味物質總含量較高(P<0.05),產香能力較強,賦予了柿子-藍莓果酒豐滿的香氣。綜上,藍莓的添加可提高果酒的抗氧化能力,同時彌補柿子果酒香味寡淡的缺陷,明顯改善果酒風味。因此藍莓添加到柿子果酒釀造中,在改善風味的同時,可開發高抗氧化性的飲品。但有關抗氧化活性增強的機理仍需進一步的探究。