冠心病病人外周血miR-126與sVCAM-1的表達(dá)及其相關(guān)性研究

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)發(fā)生主要與脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)在冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜沉積形成粥樣斑塊有關(guān)，進(jìn)而引起動(dòng)脈血管管腔狹窄、血流流速變慢，甚至堵塞，最終引起心肌缺血、梗死、心力衰竭、猝死等惡性后果。盡管人們對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究已達(dá)百年，其確切的發(fā)病機(jī)制仍然未完全研究清楚，但是普遍認(rèn)為炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化的主要致病機(jī)制之一[1-3]，白細(xì)胞在血管內(nèi)皮聚集及黏附是炎癥的起始步驟，這一過(guò)程是由血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞黏附分子及炎癥細(xì)胞所介導(dǎo)，其中血管間黏附分子-1(sVCAM-1)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系極為密切[4-6]。微小RNA(miRNA)是真核生物的非編碼RNAs小分子，miR-126是miRNAs家族中的一員，臨床研究顯示，miR-126在新生血管的調(diào)控及血管內(nèi)皮損傷修復(fù)等方面發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用[7-10]。本研究對(duì)冠心病病人外周血miR-126與sVCAM-1表達(dá)及相關(guān)性進(jìn)行了研究，以探討其在冠心病發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6月—2016年12月在我院住院確診的冠心病病人80例為研究對(duì)象(冠心病組)，其中穩(wěn)定型心絞痛病人和不穩(wěn)定型心絞痛病人均行冠脈造影檢查，冠狀動(dòng)脈主干或其主要分支狹窄程度均≥50%，符合穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有心肌病、心肌梗死、心臟瓣膜病病史者；惡性疾病、自身免疫性疾病、急慢性感染性疾病；嚴(yán)重肝腎功能異常者；應(yīng)用免疫抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑者；妊娠、哺乳期女性。80例中男47例，女33例；年齡48～82(58.92±10.14)歲；吸煙26例；高血壓37例，糖尿病11例，高脂血癥68例，急性冠脈綜合征(急性心肌梗死23例，不穩(wěn)定型心絞痛38例)61例，穩(wěn)定型心絞痛19例；冠狀動(dòng)脈受累支數(shù)為單支23例，多支57例。選取同期門診健康體檢無(wú)異常的40名中老年人為對(duì)照組，男24名，女16名；年齡40～80(61.18±9.75)歲；吸煙12名。兩組在性別、年齡、吸煙等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物、Has-miR-126莖環(huán)引物購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑購(gòu)自Takapa公司，PCR檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)羅氏公司，sVCAM-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海BG公司，M1000 Pro全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自上海首立實(shí)業(yè)有限公司。

1.2.2 血清miR-126的檢測(cè)方法 采集受試者外周靜脈血2 mL ，在離心機(jī)內(nèi)以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理15 min，分離血清，取250 μL用蛋白酶K溶解后水浴2 h，溫度56 ℃，之后按照Trizol試劑說(shuō)明提取血漿總RNA。取總RNA樣品2 μL加入水、緩沖液、RNA酶抑制劑、dNTP Mix及逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物共計(jì)10 μL，離心后在PCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37 ℃，反應(yīng)時(shí)間：60 min，所得產(chǎn)物置-4 ℃冷藏箱內(nèi)保存，GAPDH為內(nèi)參照物，以熒光定量檢測(cè)定量盒測(cè)定Hsa-miR-126莖環(huán)引物序列，分別為：上游5′-GGGGTCGTACCGTT-3′，下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，反應(yīng)預(yù)變性設(shè)定反應(yīng)條件為94 ℃，反應(yīng)時(shí)間為2 min，繼以94 ℃20 s，60 ℃34 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以real-tim e qPCR檢測(cè)miR-126的表達(dá)量，采用2-△Ct評(píng)估，△Ct=miR-126 Ct值-GAPDH Ct值。

1.2.3 血清sVCAM-1檢測(cè)方法 采集受試者外周靜脈血2 mL，在離心機(jī)內(nèi)以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理15 min，分離血清，采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定sVCAM-1。

1.2.4 血清炎性因子檢測(cè)方法 采集受試者外周靜脈血3 mL，離心處理后取上清液測(cè)定，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)以免疫透射比濁法測(cè)定，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)均以雙抗夾心法測(cè)定。所有試劑均購(gòu)于美國(guó)MARKETINC公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清miR-126、sVCAM-1及相關(guān)炎性因子表達(dá)水平比較 冠心病組miR-126表達(dá)量低于對(duì)照組，sVCAM-1及相關(guān)炎性因子表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組血清miR-126、sVCAM-1及相關(guān)炎性因子表達(dá)水平比較(±s)

2.2 冠心病病人血清miR-126、sVCAM-1及相關(guān)炎性因子表達(dá)水平比較 急性心肌梗死組miR-126表達(dá)低于不穩(wěn)定型心絞痛組和穩(wěn)定型心絞痛組(P<0.05)，不穩(wěn)定型心絞痛組低于穩(wěn)定型心絞痛組(P<0.05)，急性心肌梗死病人sVCAM-1及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、hs-CRP表達(dá)均高于不穩(wěn)定型心絞痛和穩(wěn)定型心絞痛組(P<0.05)，不穩(wěn)定型心絞痛組sVCAM-1及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、hs-CRP表達(dá)均高于穩(wěn)定型心絞痛組(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 冠心病病人組間血清miR-126、sVCAM-1及相關(guān)炎性因子表達(dá)水平比較(±s)

與急性心肌梗死組比較，①P<0.05；與不穩(wěn)定型心絞痛組比較，②P<0.05。

2.3 冠心病病人血清miR-126水平與sVCAM-1及相關(guān)炎性因子的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，冠心病病人血清miR-126與sVCAM-1 及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、hs-CRP表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 冠心病病人miR-126水平與各變量Pearson相關(guān)性分析

3 討 論

冠心病的主要病因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成及發(fā)展過(guò)程如下：脂質(zhì)條紋形成-纖維樣斑塊形成-粥樣斑塊形成-并發(fā)癥病灶形成，而且冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定型粥樣硬化斑塊的破裂是引起急性冠脈綜合征的直接原因[11-14]，在此過(guò)程中斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞及其炎癥產(chǎn)物的形成及釋放是導(dǎo)致斑塊破裂的關(guān)鍵因素，臨床大量研究證實(shí)，炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，其中細(xì)胞黏附分子(CAMs)是引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[15-16]。CAMs是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞之間互相作用的表面糖蛋白，VCAM-1是屬于黏附分子中免疫球蛋白家族成員，主要黏附在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，促進(jìn)白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等在血管內(nèi)皮細(xì)胞上黏附，引起血管內(nèi)皮損傷，同時(shí)促使單核細(xì)胞移行至內(nèi)皮下層轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，為淋巴細(xì)胞提供抗原誘發(fā)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，釋放炎癥因子促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及破裂，如VCAM-1表達(dá)上調(diào)，引起內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞之間的黏附更為牢固，穿透內(nèi)皮細(xì)胞間隙，向深部浸潤(rùn)，同時(shí)還會(huì)釋放出其他炎癥介質(zhì)引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮的損傷。sVCAM-1是VCAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落后進(jìn)入血液中的表達(dá)形式，與血栓形成、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)等均有關(guān)，發(fā)揮重要作用，在正常情況下血清sVCAM-1表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，在有炎癥反應(yīng)時(shí)sVCAM-1會(huì)明顯升高，使得炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，引起對(duì)血管內(nèi)皮及組織的損傷，臨床研究顯示，冠心病病人血清sVCAM-1明顯升高，而且與冠狀動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性也關(guān)系密切，不穩(wěn)定斑塊病人sVCAM-1會(huì)明顯高于穩(wěn)定性斑塊病人[17-19]。本研究對(duì)冠心病病人血清sVCAM-1及相關(guān)炎性因子的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示病人血清sVCAM-1及相關(guān)炎性因子表達(dá)較正常人群明顯上調(diào)，而且在急性心肌梗死病人中表達(dá)上調(diào)變化更為明顯，說(shuō)明檢測(cè)sVCAM-1及相關(guān)炎性因子不僅可作為冠心病的輔助診斷指標(biāo)，還可用于病情活動(dòng)度及嚴(yán)重程度的監(jiān)測(cè)，而且與冠心病的發(fā)生發(fā)展均關(guān)系密切。

miR-126是一種微小RNA，編碼基因位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性表達(dá)基因的第7個(gè)內(nèi)含子，對(duì)多種組織的特異性較高，如消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等均有特異性表達(dá)，但是尤以心血管系統(tǒng)特異度表達(dá)最高，與細(xì)胞的增殖及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。臨床大量研究結(jié)果顯示，血清miR-126與高血壓、冠心病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭等心血管疾病均有關(guān)，冠心病主要表現(xiàn)為冠狀動(dòng)脈血管的狹窄及堵塞[7-9]，同時(shí)有異常的血流動(dòng)力學(xué)改變，而應(yīng)激與炎癥等因素可加重其病程，其中炎癥與冠心病關(guān)系最為密切，VCAM-1是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而臨床研究已經(jīng)證實(shí)VCAM-1是miR-126的靶點(diǎn)，miR-126的表達(dá)升高同時(shí)存在VCAM-1表達(dá)下調(diào)，miR-126的表達(dá)下調(diào)同時(shí)存在VCAM-1表達(dá)上調(diào)，相應(yīng)炎性因子表達(dá)水平上調(diào)，增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。血管內(nèi)皮細(xì)胞在凋亡過(guò)程中可產(chǎn)生凋亡小體，使miR-126介導(dǎo)的趨化因子配體12的表達(dá)升高，同時(shí)還能減弱G蛋白信號(hào)16調(diào)節(jié)器的靶向作用，從以上途徑影響到冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。有研究顯示，在冠心病病人血清中miR-126的水平與血脂水平呈現(xiàn)密切相關(guān)性，是缺血相關(guān)血管生成信號(hào)的主要調(diào)節(jié)位點(diǎn)及靶點(diǎn)，是急性心肌梗死的標(biāo)記物，在心肌梗死后重構(gòu)中發(fā)揮了重要作用[20-23]。有研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死病人檢測(cè)到的miRNA中明顯表現(xiàn)為異常，推測(cè)其可能對(duì)miR-126抑制轉(zhuǎn)錄因子PIK3R2和SPRED1表達(dá)，進(jìn)而影響到成纖維生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)新生血管的生成[10]。以上研究均表明miR-126的異常表達(dá)可影響到冠心病的發(fā)生及病情進(jìn)展。本研究對(duì)冠心病病人血清miR-126表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示冠心病病人存在miR-126表達(dá)下調(diào)，而且急性心肌梗死病人較穩(wěn)定型及不穩(wěn)定型心絞痛病人miR-126下調(diào)更明顯，miR-126的表達(dá)與冠心病病情進(jìn)展有關(guān)，可影響到冠心病病情的發(fā)展。本研究對(duì)冠心病病人血清miR-126與sVCAM-1及相關(guān)炎性因子表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性研究，結(jié)果顯示血清miR-126與sVCAM-1及相關(guān)炎性因子均呈負(fù)相關(guān)性，這也進(jìn)一步提示冠心病病人血清sVCAM-1表達(dá)上調(diào)可能是miR-126在轉(zhuǎn)錄后對(duì)VCAM-1的調(diào)節(jié)失調(diào)所致，但是其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，冠心病病人存在明顯的miR-126表達(dá)下調(diào)及sVCAM-1及相關(guān)炎性因子表達(dá)上調(diào)，與病情活動(dòng)及冠狀動(dòng)脈受累嚴(yán)重程度密切相關(guān)，下調(diào)的miR-126失去對(duì)sVCAM-1及相關(guān)炎性因子的抑制可能是導(dǎo)致冠心病發(fā)生及發(fā)展的主要機(jī)制之一，在臨床上可通過(guò)檢查血清miR-126及sVCAM-1的表達(dá)進(jìn)行冠心病的病情評(píng)估。