煙草幼苗對復合鹽堿的生理響應

劉曉涵，張曉帆，李雪利，王靜，姚鵬偉，張勝，徐亮，葉協鋒

1 河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002；2 中國煙草總公司職工進修學院，鄭州 450002；3 湘西自治州煙草公司，湖南吉首 416000

土壤鹽漬化在世界范圍內普遍存在，它已經成為人們不得不面對的生態問題[1]。據不完全統計，世界范圍內的鹽漬土壤面積約為9.54 億公頃，我國鹽漬土壤面積約3460 萬公頃，占可耕地面積的1/3，且主要分布在東北、華北、西北內陸地區以及長江以北沿海地帶[1]。土壤鹽漬化是一個漸進的過程，化肥用量增加、不合理的灌溉，致使土壤次生鹽漬化狀況愈來愈重[2-3]。研究發現，河南12 個植煙區已經有部分出現次生鹽漬化現象[4]；趙莉[5]對比了2006 年和2009年湖南植煙土壤鹽分含量，發現2009 年該地區植煙土壤出現鹽分表聚現象；石紅麗[6]也表示湖南植煙土壤鹽分表聚現象嚴重。進一步分析發現，湖南植煙區SO42-、NO-3、Ca2+、K+和Na＋在土壤表層積累較多[7]；而在內陸鹽堿地，特別是松嫩平原，堿性鹽NaHCO3和Na2CO3大量存在[8]。

在鹽漬土壤中，部分土壤由于存留較多的NaHCO3等堿性鹽，導致土壤pH 升高，造成的土壤堿化問題比由NaCl 和Na2SO4等中性鹽造成的土壤鹽化問題更為嚴重[9]。在鹽堿脅迫下，植物的吸水能力減弱，葉綠素含量降低，光合作用受到影響，且隨著鹽堿濃度增大和脅迫時間延長，抑制作用愈發明顯[10]，而抗氧化酶活性和根系活力在低濃度脅迫時有增高趨勢，脅迫濃度升高，均表現降低趨勢[11]，此外，鹽堿脅迫造成的高pH 會影響植物根系對礦質元素的吸收，阻礙離子穩態的重建[12]。

近些年人們對鹽堿脅迫的研究越來越廣泛，但多數仍集中于對鹽脅迫或鹽脅迫與堿脅迫的比較方面[13-15]，關于煙草對復合鹽堿的生理響應方面研究相對較少。因此本文以復合鹽堿溶液模擬鹽堿環境，探索不同鹽堿脅迫下煙草幼苗的生理代謝反應機制，為今后相關方面研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

試驗于2017 年5～7 月在河南農業大學國家煙草栽培生理生化研究基地進行。選取耐鹽能力較弱的中煙100[16]進行漂浮育苗，按照正常育苗管理辦法進行加肥（種子由青島中煙種子有限責任公司提供；煙草漂浮育苗專用基質由山東數能信息科技有限公司提供；煙草漂浮育苗專用化肥由許昌科宏工貿有限公司提供），施加人工光源進行培養，光強為1500～1800 Lux，光照時長為13 h/d，相對濕度70%～75%。培育40 d 后選擇長勢均勻一致的煙苗，用蒸餾水培養3 d后，將裝有煙苗的育苗盤放到不同質量濃度的復合鹽堿溶液中進行處理（每個處理保留120 株煙苗，且在處理的16 d 內不加肥），復合鹽堿為n（NaCl）：n（Na2SO4）：n（NaHCO3）=1 :1 : 1，共設CK（蒸餾水）、T1（0.3%）、T2（0.6%）、T3（0.9%）和T4（1.2%）五個處理，每天上午9:00 測定鹽溶液電導率并補充蒸餾水以保證鹽濃度穩定，4 d 換一次水，處理后0 d、4 d、8 d、12 d、16 d 取樣，每個指標使用3 株煙苗，并重復3 次進行測定。各鹽堿處理的鹽分濃度與組成及對應的電導率值、pH 值見表1。

表1 復合鹽堿處理的鹽分組成與pHTab. 1 Salt composition and pH of compound saline-alkali treatment

1.2 測定項目及方法

每個處理選取具有長勢均勻一致的煙苗，保留除心葉外自上而下數的第一片葉和第二片葉，剪碎混勻后測定以下指標。葉片相對含水率采用鮮重法[17]，葉綠素采用乙醇提取研磨法[17]，細胞膜透性采用Lutts 等[18]的方法，脫落酸（ABA）、和玉米素核苷（ZR）參照酶聯免疫吸附法（ELISA）由中國農業大學測定[19]，丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法[17]，脯氨酸采用磺基水楊酸法[17]，可溶性糖采用蒽酮法[17]，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑 （NBT）法[17]，過氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法[17]。

處理后0 d、4 d、8 d、12 d、16 d，每個處理選取具有代表性的3 株煙苗，沿莖基部將根與莖分離，根系活力采用TTC 法[18]；將根系清洗干凈，盡量保證根系不斷裂破損，利用掃描儀（V700 Epson）掃描根系圖像，再用Win RHIZO PRO 2007 根系分析系統軟件（Regent Instruments Inc8，Canada）分析根系形態學參數。

1.3 數據處理

數據采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，使用Microsoft Excel 2010 作圖。

2 結果與分析

2.1 復合鹽堿處理對煙草幼苗根系的影響

從試驗第8 d 各處理根系掃描圖（圖1）可以看到，處理間根系生長已表現出較明顯差異，隨復合鹽堿濃度的增大，各處理根的數目逐漸減少，脅迫作用逐漸增強。

圖1 復合鹽堿處理對煙草幼苗根系形態的影響Fig. 1 Effects of compound saline-alkali treatment on root morphology of tobacco seedlings

圖2 復合鹽堿處理對煙草幼苗根系指標的影響Fig. 2 Effect of compound saline-alkali treatment on root indicators of tobacco seedlings

由圖2 可知，隨著鹽堿濃度的逐漸增大，煙苗總根長呈逐漸降低趨勢，T4 煙苗根長在處理時間內均表現為最短。各處理根表面積呈先增后降趨勢，低濃度處理（T1）在8～12 d 時表現出最大的根表面積，達31.18 cm2，濃度進一步增大抑制了根表面積的增加。根尖數的變化較為明顯，T1 對根尖數有促進作用，T2 對根尖數有輕微抑制，而T3、T4 處理的根尖數隨著處理時間延長先快速增加又快速下降，表明根尖對高鹽堿處理較敏感。CK 和T1 處理根系活力隨時間延長緩慢升高，T2、T3 和T4 處理的根系活力則呈緩慢下降趨勢，且有較明顯的差異，其中處理T1的根系活力在處理后12 d 達到最大值336.04 μg/（g·h），其他處理均低于CK，且始終保持T2＞T3＞T4 的狀態；CK 的根系活力持續增大，在16 d 時達到最大值384.41 μg/（g·h）。

2.2 復合鹽堿處理對煙草幼苗葉綠素含量的影響

從表2可知，各處理葉綠素含量隨時間延長呈“∧”變化，且在16 d 時，CK 處理的各項葉綠素指標均為最高；其中各處理葉綠素a含量均在第8 d達到最大值，隨后表現為鹽堿濃度越大，葉綠素a 含量越低；而葉綠素b 含量表現與葉綠素a 略有不同，T1 處理葉綠素b 含量在0～4 d 時高于CK，在12 d～16 d，各處理葉綠素b 含量和葉綠素總量均表現為CK＞T1＞T2＞T3＞T4；對比各處理葉綠素a/b 發現，處理T1、T2 葉綠素a/b整體先升后降，且在處理12 d 前均高于CK，但差異不顯著；其他處理葉綠素a/b 隨時間延長呈逐漸下降趨勢，處理16 d 時T4 葉綠素a/b 上升至1.85。

2.3 復合鹽堿處理對煙草幼苗葉片相對含水率的影響

由圖3 可知，T1、T2、T3 和T4 處理的相對含水率均隨處理時間延長和處理濃度增加而降低，在第4 d 下降明顯，T4 由85.67%降至72.56%；處理后第16 d，T1 的相對含水率為71.33%，較CK 下降16.71%，而此時T4 僅為54.64%，葉片不能維持正常的生理狀態。

圖3 復合鹽堿處理對煙草幼苗葉片相對含水率的影響Fig. 3 Effects of compound saline-alkali treatment on relative moisture content of leaf of tobacco seedlings

表2 復合鹽堿處理對煙草幼苗葉綠素含量的影響Tab. 2 Effects of compound saline-alkali treatment on chlorophyll content in tobacco seedlings

2.4 復合鹽堿處理對煙草幼苗葉片細胞膜透性及抗氧化酶的影響

由圖4a 可知，隨著復合鹽堿濃度的增大，煙草幼苗葉片細胞膜相對電導率不斷增加，即細胞透性逐漸增大；在4 d 時處理T1 的相對電導率較CK 低，未達到顯著水平，處理后8～12 d，各處理相對電導率逐漸上升且顯著高于對照處理，T4 更是在12 d 達到了85.23%；處理16 d 時，各處理電導率變化趨于平緩，T4＞T3＞T2＞T1＞CK。MDA 含量變化與細胞膜透性大致相同，即處理濃度越大，時間越長，MDA 含量越高，處理后16 d 時，復合鹽堿處理中T1 和T2 變化較慢，T3 和T4 持續增大，分別達到52.35 和59.24 nmol/g（圖4b）。

由圖4c-d 可知SOD 酶活表現為CK 和T1 變化波動相對較小，T2、T3 和T4 先升后降，在處理后第8 d，T4 處理SOD 酶活達到最高，為171.06 U/（g·h），其他鹽堿處理呈下降趨勢。CAT 活性的變化趨勢與SOD 相似，但處理間差異變化更大且前期反應更為迅速，處理后0～8 d，各處理均呈上升趨勢，第8 d各鹽堿處理達到最大值，此時T4＞T3＞T2＞T1＞CK，隨時間增加，鹽堿處理的CAT 活力開始降低，第16 d 各處理間已無明顯差異。

2.5 復合鹽堿處理對煙草幼苗滲透調節物質的影響

圖4 復合鹽堿處理對煙草幼苗葉片細胞膜透性及抗氧化酶的影響Fig. 4 Effects of leaf saline-alkali treatment on cell membrane permeability and antioxidant enzymes of tobacco seedlings

圖5 復合鹽堿處理對煙草幼苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響Fig. 5 Effects of compound saline-alkali treatment on soluble sugar and proline contents in tobacco seedling leaves

由圖5 可知，4 d 時隨著復合鹽堿濃度的增大，可溶性糖含量呈增加趨勢；處理后4～8 d，處理T4 逐漸下降，其他處理逐漸升高；處理后第12 d，T4 快速下降至0.81%，其他處理緩慢上升；處理后12～16 d，各處理均有下降趨勢，T3 和T4 均低于CK。脯氨酸含量的變化趨勢，除CK 持續升高外，其他處理先升后降。復合鹽堿脅迫4 d 后，各處理脯氨酸含量均有一定增長，且均高于對照；8 d 時，處理間脯氨酸含量為T4＞T3＞T2=T1＞CK；處理后第12 d，除T4 外，其他處理持續升高；處理后12～16 d，除CK 略有上升外，其他均呈下降趨勢。

2.6 復合鹽堿處理對煙草幼苗根尖ABA 和ZR 含量的影響

由圖6 可知，復合鹽堿處理下根尖ABA 含量變化相對平緩，主要集中在20～40 ng/g。處理后第4 d，處理T1 和T2 有所下降，CK、T3 和T4 均隨時間延長而升高；處理12～16 d，T1 和T2 根尖的ABA 含量有所下降，T3、T4 則急劇上升，第16 d 分別達到50.00 和57.29 ng/g，較對照增加71.35%和96.33%。鹽堿處理下根尖ZR 含量變化波動較大，處理后第4 d，各鹽堿處理根尖ZR 含量快速升高，且均高于CK；處理后第8 d，處理T1 根尖ZR 含量達到最高值，為9.75 ng/g，且各鹽堿處理均高于CK；處理后8～12 d，處理T1 和T2 根尖ZR 含量逐漸下降；12 d 時處理T3 達到最大值，為12.56 ng/g；處理后16 d，CK 高于各鹽堿處理。

圖6 復合鹽堿處理對煙草幼苗根尖ABA 和ZR 含量的影響Fig. 6 Effects of compound saline-alkali treatment on ABA and ZR contents in root tip of tobacco seedlings

3 討論

根系的生長存在很大的可塑性，它能夠通過改變形態與分布來適應不利環境，在鹽堿脅迫下根部是面對脅迫的首要部位。所以根的生長發育狀況和活力對植物的耐鹽能力至關重要[20]。本研究發現在輕度鹽堿脅迫下，煙苗總根長相對CK 變短，可能是煙苗根系為減少Na+的吸收而做出的適應性變化[21]，在鹽堿處理12 d 時，特別是T3、T4 的許多根尖由白嫩變褐腐爛，16 d 時這種情況更加普遍，可能是長期高鹽堿環境導致幼嫩的分生組織壞死，不能持續生長[22]。同時鹽堿處理降低了煙苗的根系活力，這可能是鹽堿環境中高pH 所產生的抑制作用，丁俊男等[23]試驗也證明了根活與pH 呈極顯著負相關。該處理根系的變化趨勢與前期所做復合鹽處理條件下變化趨勢大致相似。鹽分積聚造成根際的高滲透勢，使得根系的礦質營養狀況及氧氣供應能力嚴重破壞，而較高的pH 又迫使根系合成并積累大量的有機酸，因此導致細胞內離子失衡、代謝紊亂，最終植物根系生長受到破壞[24]。

鹽堿脅迫對根系的生長發育造成破壞，影響了營養物質向地上部的運輸，進而造成地上部分生長受抑制，光合作用受到影響[25]。本文研究表明在0～8 d 時，T1 處理的葉綠素含量高于CK，這可能是在鹽堿脅迫下葉綠素合成前體物δ-氨基酮戊酸（ALA）、膽色素原（PBG）和尿卟啉原Ⅲ（Uro Ⅲ）大量積累[26]，促進了葉綠素的合成；而在8～12 d，隨著鹽堿濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b 的含量和葉綠素a/b 逐漸下降，這可能是鹽堿脅迫引起了葉綠素的降解[27]，同時葉綠素比例發生變化[28]所致；薛延豐等[29]認為鹽堿脅迫造成的葉綠素含量下降可能是堿性鹽脅迫破壞了細胞微環境的酸堿平衡，影響葉綠體類囊體兩側H+濃度梯度的建立，從而降低了葉綠體中ATP 合成的動力。對于試驗中處理后16 d 部分處理葉綠素升高的現象，這可能是因為脅迫時間越長，植株代謝紊亂越嚴重，導致葉片葉綠素與蛋白間的結合變得松弛，使得在測定中葉綠素更容易被提取，從而造成復合鹽堿處理的葉綠素含量有升高趨勢[30]。在復合鹽脅迫與復合鹽堿脅迫下，煙草幼苗的葉綠素含量均減少，與前期復合鹽試驗數據相比，在相同離子濃度情況下，復合鹽堿脅迫處理的煙草幼苗葉綠素含量降幅更大。

本試驗中鹽堿處理的可溶性糖和脯氨酸含量的變化與葉綠素的變化規律相似，均呈現先升后降的趨勢，這是由于脯氨酸的合成有賴于碳水化合物通過氧化磷酸化作用提供的氫和還原能力[31]，長時間鹽堿作用下導致光合能力受到抑制，提供還原能力減弱，導致后期脯氨酸含量下降；同時ABA 可以促進脯氨酸的合成，影響細胞內H+分泌，改變細胞液內酸堿平衡，這也是脯氨酸含量變化波動較大的原因[24,32]。同時與復合鹽處理結果對比發現，復合鹽堿傷害更大，在復合鹽處理下，可溶性糖和脯氨酸含量呈上升趨勢；在復合鹽堿脅迫條件下隨著濃度的增大，兩種物質含量在某一濃度達到峰值后，呈現下降趨勢，表明鹽堿脅迫能使煙苗更早達到耐鹽閾值，進而導致其滲透調節系統失衡。

周瑞蓮等[33]指出植物細胞中水分狀況與有機滲透調節物多少有關，水分狀況良好時，將更多光合產物用于生長，限制有機滲透調節物的合成及可溶性糖向根輸入；在細胞缺水時，則促使脯氨酸和可溶性糖等有機滲透調節物合成含量增加。本文研究結果顯示，鹽堿處理的煙苗葉片含水率隨著時間延長逐漸降低，葉片缺水可能是有機滲透調節物合成的另一誘因。從這兩種物質含量的變化可以看出短期脅迫下植物應激反應較強，而長時間處于脅迫狀態，植物抗鹽堿能力逐漸降低。

許多研究指出激素對植物抗逆性的調節不依賴于單一激素的絕對含量，是各類激素達到一個動態平衡狀態[29]。本研究結果顯示隨著處理時間的延長，煙草幼苗體內ABA 含量呈波動式增長，這與前期復合鹽處理試驗結果變化趨勢和劉磊[34]研究鹽堿脅迫下甜菜苗期的結果相似，可能是脅迫條件下，植物體內維持ABA 與ZR 的平衡，控制氣孔開閉，改變葉片氣孔阻力，從而減少水分蒸發抵御高鹽脅迫[35～36]。從結果來看，初期脅迫誘導植物產生應激反應，根部抗逆能力增強，合成ZR增多，與前期進行的鹽脅迫相比，增幅更加明顯。隨脅迫時間的增長，分生組織細胞膜受到破壞，合成功能受阻[30]。

綜上所述，煙草幼苗在低濃度的復合鹽堿處理下根系發育狀況良好，葉片合成葉綠素可維持正常代謝，自身的滲透調節、激素及相關酶系統仍處于動態平衡狀態。隨著脅迫程度的增加，根系發育遲緩，葉綠素含量和葉片含水率有降低趨勢，而細胞膜不同程度受損，體內滲透調節物質合成增多，激素含量變化較大，煙苗生長受阻。然而在復合鹽堿處理下，不同生育期的煙株生理代謝狀況會有哪些變化，還有待進一步研究。

4 結論

低濃度的復合鹽堿處理在一定程度上促進葉綠素合成，且短時低鹽堿脅迫對根表面積及根活等有不同程度的促進；高濃度、長時間的復合鹽堿脅迫會對煙草幼苗細胞膜、葉綠素及根系造成損傷，且濃度越大、時間越長抑制效果越明顯。

遭受脅迫后，煙草幼苗的內源激素、有機滲透調節物質及抗氧化酶系統均在短期內做出了響應。隨著處理濃度的增加和時間的延長，根系生長受阻，葉綠素含量逐漸下降，ABA、可溶性糖和脯氨酸含量均呈下降趨勢，植物體內的代謝紊亂。