沙棘多糖對D半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用

包曉瑋,李建瑛2,任 薇,魏晨業,曾蘭君,張亞濤

(1.新疆農業大學食品科學與藥學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆軍區總醫院,新疆烏魯木齊 830052)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科灌木或小喬木,廣泛分布于歐亞的溫帶地區[1]。沙棘具有優異的生態效益和經濟價值,耐寒、耐旱、耐鹽堿、耐脊薄,萌生繁殖能力強,固氮能力強[2-3]。中國新疆地區由于其特殊的氣候環境和地貌特征,栽培了大面積的沙棘改善生態環境。沙棘為藥食兩用植物[4],果實成熟為橙黃色,果肉油潤光滑。

沙棘果實含有豐富的生物活性物質,如礦物質、維生素、碳水化合物、不飽和脂肪酸、黃酮類化合物、有機酸及揮發性物質等[5-6],沙棘及提取物具有免疫調節、抗氧化、降血脂和肝損傷的保護作用[7-10]。實驗室前期從沙棘干果實中提取和純化得到沙棘多糖(PBP),發現PBP具有良好的體外抗氧化作用[11]。

多糖是自然界中廣泛存在的一類生物大分子,被認為是繼核酸和蛋白質之后的第三類生物信息大分子。有研究表明紅托竹蓀多糖使D-gal模型小鼠血清、肝腦組織中SOD、GSH-Px活性增加,MDA含量降低[12];淡竹葉多糖對D-gal模型小鼠的跳臺和Morris水迷宮實驗表明,可以使衰老小鼠的學習能提高[13];金釵石斛多糖對H2O2誘導HepG2細胞損傷模型的抗衰老活性表明,金釵石斛多糖能夠提高損傷細胞存活率[14]。隨著年齡增長,身體抗氧化防御能力逐漸下降,這樣就會導致形成和清除活性氧ROS發生不平衡,進而導致組織組織損傷引起的衰老[15]。為了避免細胞和組織損傷,機體有一套完整的防御系統,能夠完全消除自由基和脂質過氧化物,這套系統包括SOD及GSH-Px[16-17]。抗氧化劑常用作抗衰老劑,這是由于其有潛在的清除自由基的作用,然而,人工合成的氧化劑由于其在長期使用中會產生副作用而受到限制[18],天然植物多糖作為生物活性物質具有低毒性,因此,開發天然無毒的植物多糖作為抗氧化劑是非常重要和必需的,該研究結果為開發PBP作為天然的抗氧化劑并在抗衰老中的作用提供理論依據。基于多糖的抗氧化作用以及SOS、GSH-Px在抗衰老的作用,并結合前期開展的PBP體外抗氧化方面的研究基礎,本研究用分離的PBP灌胃經D-半乳糖皮下注射誘導的衰老模型小鼠,計算臟器指數,并測定其肝臟、腦組織勻漿及血清中的SOD、GSH-Px活性和MDA含量,并結合肝臟和腦組織病理切片,評價PBP對衰老模型小鼠體內抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PBP 實驗室制備提供[11];KM小鼠 雄性,五周齡,體重(20±2) g,購于新疆醫科大學實驗動物中心(批號:SCXK(新)2018003),清潔級;D-半乳糖 上海國藥試劑集團;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒 購于南京建成生物工程研究所;其他試劑 均為分析純。

AL204-4C電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL-21M高速冷凍離心機 上海盧湘儀科學儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;BIO-RAD酶標儀 美國BIO-RAD公司;AE-31數碼倒置顯微鏡 麥克奧迪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 將適應性飼養3 d后的60只健康的KM雄性小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組(VE170 mg/kg)、PBP低劑量組(100 mg/kg)、PBP中劑量組(200 mg/kg)、PBP高劑量組(400 mg/kg),每天除空白組頸部皮下注射0.2 mL/10 g生理鹽水,其余各組均頸部皮下注射D-半乳糖溶液(120 mg/kg),然后空白組和模型組灌胃生理鹽水0.1 mL/10 g,陽性組灌胃(VE170 mg/kg),其余各組按高、中、低連續灌胃PBP 30 d。灌胃期間每3 d稱量一次體重。

1.2.2 臟器指數測定 末次給藥禁食24 h后,眼球取血并分離血清。摘取肝臟及腦組織,用冷的生理鹽水洗凈各臟器組織,用吸水紙將水吸凈,并稱重各臟器組織重量,用于測定各臟器組織臟器指數。

臟器指數=臟器重量(g)/小鼠體重(g)

1.2.3 小鼠血清、肝組織及腦組織中SOD、GSH-Px活力及 MDA含量測定 利用冰浴過的生理鹽水制備10%的肝勻漿和腦勻漿2 mL,將制備后的勻漿于12000 r/min低溫離心10 min,將離心后的上清取出,按照試劑盒操作測定小鼠血清、肝臟組織和腦組織均漿液超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力及丙二醛(MDA)含量。

1.2.4 病理切片制作 取各組動物肝臟和腦組織用10%甲醛固定后,水洗、脫水和脫色;浸蠟和包埋;修塊、切片、貼片和展片;脫蠟、HE染色與鏡檢。

1.3 數據處理

2 結果及分析

2.1 體重及臟器指數測定

圖1 實驗小鼠30 d內體重變化Fig.1 Weight change in experimental mice within 30 d

由圖1看出,灌胃的30 d內各組動物體重均呈現出增長趨勢。7 d后,模型組動物體重總體低于其他各組,該趨勢一直持續到30 d;總體看來,在10～13 d期間,低劑量組動物體重與模型組體重相近,其余各組高于模型組;在13 d后各組動物體重均高于模型組;在19～30 d期間,中劑量組與VE組小鼠體重基本相近,高劑量組體重稍低于空白組,但高于其余各組。體重可以作為機體生理變化的一個指標,此體重的走勢可以說明,隨著衰老模型動物造模天數的延長,動物的體重也會隨著下降,可以表明隨著動物的衰老其體重會下降,但通過給衰老模型小鼠灌胃PBP后具有緩解體重下降的作用。

表1 PBP對衰老小鼠臟器指數的影響Table 1 Effects of polysaccharide from Hippophae rhamnoides on organs indexes in aging mice

表2 PBP對小鼠肝、腦及血清中GSH-Px活性的影響Table 2 Effects of PBP on the activities of GSH-Px in liver,brain and serum of aging

由表1可知,模型組與空白組比較,除腎臟指數顯著下降(P<0.05)外,其余各臟器指數極顯著下降(P<0.01)。與模型組相比,PBP低劑量組腦指數顯著增加(P<0.05),對心臟、肝臟、脾臟及腎臟臟器指數無顯著影響(P>0.05);PBP中劑量組腦指數極顯著增加(P<0.01),心臟、脾臟指數顯著增加(P<0.05),對肝臟、腎臟指數無顯著影響(P>0.05);PBP高劑量組極顯著提高腦及心臟指數(P<0.01),顯著提高脾臟指數(P<0.05),對肝、腎臟指數增加不顯著(P>0.05)。臟器指數的變化可以反映出各器官的衰老情況,腦指數降低表明動物神經組織出現萎縮[19]。

心臟指數下降表明動物心功能的下降,心臟及腦功能的下降,會誘發機體進一步的衰老;肝臟和腎臟指數的降低表明動物的代謝能力下降;脾臟指數下降表明小鼠免疫功能下降[20]。PBP灌胃給衰老小鼠后,中、高劑量組對衰老小鼠的腦、心臟及脾臟指數的降低有緩解作用,而且效果顯著,低劑量效果不顯著。總體評價,PBP對于衰老引起的腦組織萎縮、心臟功能下降及免疫功能的下降有緩解作用且該作用具有劑量依賴性,但實驗結果可以表明,PBP對緩解衰老小鼠肝臟及腎臟指數的降低雖然沒有顯著作用,但是PBP高劑量可以表現出提高小鼠肝臟及腎臟指數,該結果可能是因為PBP對肝臟和腎臟指數的影響需要更高劑量才能表現出來。總體而言,PBP具有延緩衰老小鼠臟器退化的作用。

2.2 小鼠血清、肝組織及腦組織相關指標測定

2.2.1 GSH-Px活力測定 表2可知,模型組與空白組相比,小鼠的肝臟、腦組織及血清中的GSH-Px活力均極顯著低于空白組(P<0.01),表明造模成功。與模型組相比,VE對照組肝勻漿中及血清中GSH-Px活性極顯著增加(P<0.01),腦組織GSH-Px活性顯著增加(P<0.05);PBP低劑量組肝勻漿中GSH-Px活性極顯著增加(P<0.01),血清與腦勻漿GSH-Px活性增加不顯著(P>0.05);PBP中劑量組肝、腦勻漿及血清中的GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01);PBP高劑量組血清、肝和腦組織GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01)。

GSH-Px通過特異性催化谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應,發揮保護細胞膜的作用。本實驗結果表明,PBP作用于衰老模型動物后,動物血清、肝臟及腦組織中GSH-Px活性均提高,說明PBP能夠通過提高GSH-Px的活性來增強細胞穩定性,進而增強機體穩定性延緩衰老。

2.2.2 SOD活力測定 由表3可知,模型組與空白組相比,小鼠的肝臟及血清中的SOD活力均極顯著低于空白組(P<0.01),腦組織中SOD活力顯著降低(P<0.05),表明造模成功。與模型組相比,VE組肝臟中SOD活性顯著增加(P<0.05),血清及腦勻漿SOD活性活性極顯著增加(P<0.01);PBP低劑量組血清中SOD活性極顯著增加(P<0.01),肝臟及腦組織SOD活性增加不顯著(P>0.05);PBP中劑量組血清中SOD活性增加(P<0.01),腦組織SOD活性顯著增加(P<0.05),肝臟SOD活性增加不顯著(P>0.05);PBP高劑量肝臟、腦勻漿及血清中SOD活性均極顯著增加(P<0.01)。

抗氧化酶活性的作用的評價體系中,SOD是生物體內重要的抗氧化酶,是生物體內清除自由基的首要物質。在氧化應激引發的衰老中,SOD的活性受到明顯的影響,大量研究表明,在衰老動物模型、炎癥動物模型、癌癥動物模型等研究中,模型動物血清和組織SOD含量明顯下降,說明SOD水平與機體衰老是正相關的[21-22]。本實驗結果表明,PBP高劑量作用于衰老模型動物后,動物血清、肝臟及腦組織中SOD活性均極顯著提高(P<0.01),表明PBP能夠改善衰老動物機體抗氧化能力,進而可以延緩衰老。

表3 PBP對小鼠肝、腦及血清中SOD活性的影響Table 3 Effects of PBP on the activities of SOD activity in liver,brain and serum of aging

表4 PBP對小鼠肝、腦及血清中MDA含量的影響Tasble 4 Effects of PBP on the contents of MDA in liver,brain and serum of aging

2.2.3 MDA含量測定 由表4可知,模型組與空白組相比,小鼠的肝臟、腦組織勻漿及血清中的MDA含量均極顯著增加(P<0.01),表明造模成功。與模型組相比,VE組肝臟、腦組織及血清中MDA含量極顯著下降(P<0.01);PBP低劑量組肝、腦組織中MDA含量下降不顯著(P>0.05),血清中MDA含量極顯著下降(P<0.01);PBP中劑量組肝勻漿和血清中MDA含量極顯著下降(P<0.01),腦組織中MDA含量下降不顯著(P>0.05);PBP高劑量組肝臟、腦組織及血清中MDA含量極顯著下降(P<0.01)。

MDA是脂質過氧化的重要產物之一,是衡量機體內自由基代謝的特征指標,MDA的含量能夠客觀反映體內自由基的水平,降低MDA含量是抗氧化研究中的一個重要機制[23]。許多研究表明,無論是D-半乳糖模型、輻照模型、臭氧損傷模型還是快速老化模型,都可以觀察到血清和組織細胞中MDA含量增加,隨著MDA的增多,會逐漸導致細胞和組織器官損傷,進而會引起疾病[24-26]。本實驗結果表明,PBP作用于衰老模型動物后,動物血清、肝臟及腦組織中MDA含量均顯著降低(P<0.05),進而表現出對衰老動物的抗氧化作用。

2.3 PBP對衰老大鼠肝、腦組織形態的影響

由圖2可以看出,正常組中肝細胞以中央靜脈為中心樹狀有序排列,肝細胞膜完整,竇間隙明顯,胞體正常。模型組的肝細胞排列無序,肝臟的局部區域肝細胞明顯腫脹,肝細胞膜被破壞,結構消失,細胞間組織相互融合,竇間隙消失。VE組的肝細胞排列有序,有個別細胞略微腫脹,竇間隙變窄,細胞變圓,包漿中有少量顆粒性物質。PBP低劑量組的肝細胞腫脹明顯,細胞核大小不一(肝細胞代謝增強),竇間隙消失,細胞膜破碎,細胞間組織相互融合。PBP中劑量組的肝細胞腫脹,細胞核大小不一,竇間隙變窄,胞漿中可見少數空泡和顆粒性物質。PBP高劑量組中肝細胞膜形態完整,竇間隙明顯,肝細胞排列有序。總體而言,衰老模型動物肝細胞形態、排列及肝竇間隙均異常,PBP高劑量組能夠改善因衰老而導致的肝細胞異常,效果最明顯;PBP中劑量組也能改善因衰老導致的肝細胞異常,但效果不及高劑量組。

圖2 各組動物肝組織切片 HE 染色結果(200×)Fig.2 The results of tissue slicing of liver sections by HE staining in each group(200×)注:A～F分別表示正常組、模型組、VE組、PBP低、中、高劑量組。

由圖3可以看出,正常組神經元結構完整,膠質細胞無集結現象。模型組中腦細胞呈網格狀大面積壞死,神經細胞固縮,胞體體積變小,結構不完整。VE組的神經元細胞狀態良好,膠質細胞無集結現象。PBP低劑量組中膠質細胞明顯增多,大量膠質細胞聚集(腦組織壞死),神經細胞壞死。PBP中劑量組膠質細胞輕微聚集,神經元細胞腫脹,邊緣尼氏小體溶解。PBP高劑量組的神經細胞數量明顯增多,細胞核居中,胞質狀態良好,尼氏體正常。總體而言,衰老模型動物表現腦細胞壞死,神經細胞固縮,胞體體積變小,結構不完整,PBP高劑量組能夠改善因衰老而導致的腦細胞異常,使細胞回復正常形態,作用效果明顯;PBP中劑量組作用效果不及高劑量組。

圖3 各組動物腦組織切片 HE 染色結果(200×)Fig.3 The results of tissue slicing of brain sections by HE staining in each group(200×)注:G～L分別表示正常組、模型組、VE組,PBP低、中、高劑量組。

3 討論與結論

小鼠體內由于在D-半乳糖造成的亞急性中毒狀態下,體內產生大量超氧陰離子自由基,對組織產生過氧化損害,這種生化和組織結構的改變與自然衰老表現基本吻合[27],本實驗通過建立D-gal致衰老模型評價PBP對衰老模型小鼠抗氧化作用。D-gal致衰老模型小鼠出現了模型組體重比正常組體重下降,心臟、腦組織、肝臟、脾臟及腎臟的臟器指數下降,模型組小鼠肝臟、腦組織及血清中的SOD、GSH-Px活性降低及MDA含量增加,這些指標的變化說明了動物表現出衰老。

通過灌喂PBP給D-半乳糖造成的衰老模型小鼠后,PBP(400 mg/kg)劑量可以緩解衰老模型小鼠的體重下降趨勢,PBP(200、400 mg/kg)可提高衰老小鼠心臟、腦組織及脾臟臟器指數,PBP(200、400 mg/kg)可提高衰老小鼠肝臟、腦組織及血清SOD和GSH-Px活性,降低肝臟、腦組織及血清的MDA含量,(400 mg/kg)使衰老小鼠的肝臟及腦組織的細胞形態及結構可以得到正常恢復。這些結果表明PBP能夠有效地緩解和改善衰老,而且作用效果具有劑量依賴性,PBP可能是通過抗氧化作用延緩衰老作用的。