正源抗栓蜜丸對角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用研究

林希釩 王振 何世勇 官睿璇 張琳 郁萬剛

【摘 要】 目的：研究正源抗栓蜜丸對角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用。 方法：60只雄性KM小鼠隨機分為六組，連續灌胃相應藥物和生理鹽水7 d，第7次灌胃后除空白組外其余各組小鼠腹腔注射角叉菜膠（40mg·kg-1）造模，24 h后觀察小鼠行為狀態變化并予以麻醉，以組為單位拍攝且測量小鼠尾部血栓長度，測量完成后處死小鼠。結果：低劑量（1.0g·kg-1）正源抗栓蜜丸明顯降低小鼠尾部血栓長度和小鼠尾部血栓相對長度（P<0.01）;中劑量（2.0 g·kg-1）正源抗栓蜜丸明顯降低小鼠黑尾率、小鼠尾部血栓長度和小鼠尾部血栓相對長度（P<0.01或P<0.05）;心腦康膠囊（6.0 g·kg-1）和高劑量（4.0 g·kg-1）正源抗栓蜜丸同樣降低小鼠黑尾率、小鼠尾部血栓長度和小鼠尾部血栓相對長度，但差異不明顯（P>0.05）。結論：一定濃度的正源抗栓蜜丸能夠顯著抑制角叉菜膠致小鼠尾部血栓，具有治療缺血性腦卒中的潛能。

【關鍵詞】 正源抗栓蜜丸;小鼠;角叉菜膠;血栓;缺血性腦卒中

【中圖分類號】R285.5 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）21-0019-05

Abstract：Objective To study the effect of Zheng Yuan Kang Shuan pills（ZP） ?on tail thrombosis induced by carrageenin in mice.Methods 60 male KM mice were randomly divided into six groups and given relevant medicine and normal saline intragastrically， once a day， for 7 consecutive days.Except for blank group， other mice were injected with carrageenin （40 mg·kg-1） intraperitoneally to establish the model after 7th intragastric. 24 hours later， the changes in the behavioral state of the mice were observed and the mice were anesthetized， the tail thrombus of the mice which was shot and measured in groups. After the activities were finished， the mice were executed. Results Thelow dose （1.0 g·kg-1） ZP significantly reduce the length and the relative length of tail thrombosis in mice （P<0.01）. The medium dose （2.0 g·kg-1） ZP significantly reduce the black-tail rate， the length of and the relative length of tail thrombosis in mice （P<0.01 or P<0.05）. Xinnaokang capsules（XC） （6.0 g·kg-1） and the high dose ZP（4.0 g·kg-1） also reduce the black-tail rate， the length and the relative length of thrombosis in mice， but the difference was not significant （P>0.05）.Conclusion ZP of the certain concentration can obviously inhibit the tail thrombosis induced by carrageenin in mice and has the potential to treat cerebral ischemic stroke.

Keywords：Zheng Yuan Kang Shuan Pills（ZP）; Mice; Carrageenin;Thrombosis; Cerebral Ischemic Stroke

腦卒中是世界范圍內的一種高發性、高危性腦血管疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占87%，其1年內的致死率約10%，致殘率也高達34%[1]。中國缺血性腦卒中患者數目龐大，年輕化明顯，病死率和復發率遠高于世界平均水平，是家庭和社會的沉重負擔。近年來，我國積極開展腦卒中的防治工作，不斷加大對于腦卒中臨床和基礎研究的投入，取得了一定成績，但國內腦卒中防治局勢依然嚴峻，防治手段有待進一步優化[2-3]。

血栓指血管內有形成分相互作用、聚集所形成的團塊狀固體，依據其形成部位的不同可分為動脈血栓和靜脈血栓，以動脈血栓最為常見。作為中樞器官，腦參與完成機體各種生命活動，豐富的能量需求使得腦部血供系統復雜且脆弱，腦部血管易產生血栓而堵塞，導致周圍腦組織血供不足，引發缺血缺氧性變性及壞死，繼而影響腦的正常生理功能[2]。因此目前缺血性腦卒中的臨床治療多從血栓入手，主要采用溶栓和抗凝兩種方法，同時以支架置入術為主的介入治療也迅速發展，該病治愈率有所提高[3]。然而抗血小板治療抵抗、介入術后的再灌注損傷、抗凝藥物引起腦出血等問題依舊嚴重，探尋更為有效的治療方法成為相關醫務工作者的首要任務[4-5]。

中醫藥作為中華民族的傳統瑰寶，其“辨證論治”的思想對于多種疾病的治療具有重要的指導意義。對于缺血性腦卒中，中醫學者從氣血運行理論出發，確立了活血化瘀為主，益氣補血相輔的治療理念，同時積極研發以心腦康膠囊、脈絡寧注射液為主要代表的現代中藥劑型，在實際臨床應用中取得了相當不錯的效果[6-7]，為缺血性腦卒中的治療提供了更加廣闊的思路。

本課題組長期致力于缺血性腦卒中的中醫藥療法，通過前期文獻調研并結合老中醫臨床經驗確定以蝮蛇、黃芪為君藥，天麻、水蛭、丹參為臣藥;川芎、雞血藤、地龍為佐藥;麝香為使藥的關鍵復方，以中藥細粉配合蜂蜜制得便攜式蜜丸，取名正源抗栓蜜丸。其中蝮蛇、水蛭、地龍均屬蟲藥，其藥性善走，可祛風通絡、除瘀消癥;黃芪、丹參、雞血藤活血通經、益氣補虛;天麻、川芎、麝香消瘀止痛、養血活血。諸藥聯用，共奏活血化瘀、補虛通絡之效。同時現代研究發現水蛭能夠作用于纖維蛋白原、纖溶酶原等參與血栓形成的重要分子，調節凝血級聯反應和血小板活化[8]，從而實現抗血栓效應;黃芪含有的黃芪總皂苷可增強前列腺環素合成酶活性，抑制血小板聚集;丹參通過抑制血栓素A2合成實現血小板聚集的抑制作用[9];蝮蛇、天麻、川芎等能夠抗氧化應激、保護內皮細胞以及促進血管新生[10-12]。以上發現提示正源抗栓蜜丸具有良好的抗血栓和腦保護作用，能夠作為臨床治療缺血性腦卒中的潛力藥物。現探究正源抗栓蜜丸對角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用，為其下一步臨床應用提供佐證。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性KM小鼠60只，體重為（25±5）g，由大連醫科大學SPF動物實驗中心提供[動物使用許可證號：SYXK-（遼）2018-0007]

1.2 藥品和器械 正源抗栓蜜丸（批號：20191012，規格：0.3 g）;心腦康膠囊（吉林密之康藥業有限公司，批準文號：國藥準字Z22025480）;L型角叉菜膠（上海津頌實業有限公司）;水合氯醛（上海信裕生物科技有限公司）;生理鹽水（江西科達衛生用品公司）;一次性使用無菌注射器（大連JMS醫療器具有限公司）;游標卡尺（日本三豐儀器）;灌胃針頭（北京合力科創科技發展有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 將適應性飼養一周的雄性KM小鼠隨機分為六組，即空白組、模型組、心腦康膠囊組（6.0 g·kg-1）、正源抗栓蜜丸低劑量組（1.0 g·kg-1）、正源抗栓蜜丸中劑量組（2.0 g·kg-1）和正源抗栓蜜丸高劑量組（4.0 g·kg-1），每組10只。稱重后灌胃相應藥物和生理鹽水，灌胃體積為1 mL/100 g，每日1次，連續7 d。

2.2 模型制備 依據文獻記述[14，17-18]并結合預實驗結果制備小鼠尾部血栓模型。第7次灌胃后，除空白組外其余各組小鼠腹腔注射L型角叉菜膠（40 mg·kg-1）并將其尾部浸入0～4 ℃冷水進行低溫刺激，1 min后撈出并擦干。

2.3 數值測定 造模24 h后觀察小鼠行為變化并以10%水合氯醛（1 mL/300 g）進行麻醉，然后以游標卡尺測量小鼠尾部全長以及血栓長度，同時以組為單位拍攝小鼠尾部血栓照片。數值測定完成后處死小鼠。

2.4 數據分析 實驗數據采用 SPSS17.0軟件進行分析，對符合條件組采用單因素方差（ one-wayANOVA） 分析，不符合條件組采用非參數秩和檢驗分析，同時黑尾率采用卡方檢驗FISHER概率法。分析結果以平均數±標準差（x±s）表示，P<0.05即差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠行為狀態的變化 空白組小鼠狀態如常，模型組小鼠飲食差、活動性弱、畏冷，其余各組小鼠行為狀態明顯優于模型組，以正源抗栓蜜丸中劑量組小鼠最佳。

3.2 小鼠尾部血栓 造模24 h后，各組小鼠尾部不同程度地出現暗紅色血栓，同時部分小鼠尾部血栓干枯脫落形成斷尾。如圖1所示。

3.3 小鼠黑尾率、尾部血栓長度和尾部血栓相對長度的比較 與空白組小鼠相比，模型組小鼠黑尾率達100%，尾部血栓約占全尾長度的25%，差異顯著（P<0.01），提示模型制備成功。與模型組小鼠相比，心腦康膠囊組小鼠及正源抗栓蜜丸高劑量組小鼠的黑尾率、尾部血栓長度和尾部血栓相對長度均有所降低，但差異不明顯（P>0.05）;正源抗栓蜜丸低、中劑量組小鼠的尾部血栓長度、尾部血栓相對長度以及正源抗栓蜜丸中劑量組小鼠的黑尾率降低，且差異顯著（P<0.01或P<0.05）。詳見表1。

4 結論

角叉菜膠又名卡拉膠、鹿角菜膠，屬于多糖混合物，廣泛應用于醫療、食品、化工等諸多領域，分為K型 （Kappa） 、I型 （Iota） 、L型 （Lambda）三種，能夠刺激機體釋放以IL-1β為主的多種炎性因子，損傷血管內皮的同時激活凝血酶、活化血小板，使血小板與受損的內皮細胞相互黏附，形成血小板小梁。而受損的內皮細胞產生的凝血因子誘發凝血級聯反應，使得血流速度減緩，大量紅細胞吸附在血小板小梁上，從而形成血栓[13]。角叉菜膠致小鼠尾部血栓之法乃胡三覺教授等[14]自國外引入，相較于創傷性手術造栓，該法操作簡便、成本低廉、人為因素干擾少、尾部血栓的形成十分直觀，該方法已在抗血栓類藥物的功效研究方面得到廣泛應用[15-16]。劉彥霞等[17]發現相較于皮下注射，腹腔注射能夠顯著提高小鼠尾部出栓率和出栓速度，同時劑量、溫度、濕度等因素對于小鼠尾部出栓具有一定影響;張俊林等[18]認為同等條件下雄鼠較雌鼠更易出栓，L型角叉菜膠較I型出栓率更高且血栓相對長度更長。故本課題組以雄性KM小鼠和L型角叉菜膠作為實驗基本材料，通過腹腔注射造模，同時控制實驗溫度為（15±5）℃，濕度為20%，以保證小鼠的出栓率，為探究正源抗栓蜜丸對小鼠尾部血栓作用提供基礎。

小鼠尾部僅腹側一條尾動脈，左右兩側以及背側血管均為靜脈，屬于典型的單動脈供血，正常情況下血液沿尾動脈從尾根向尾梢流動，在流動過程中與周圍組織細胞不斷進行物質交換以保證能量供應，然后通過三條靜脈實現血液回流。小鼠腹腔注射角叉菜膠后，在炎性因子的刺激下發生血管內皮的損傷，小鼠尾梢部分在24 h內形成暗紅色血栓并不斷向尾根部延伸，由于缺少側枝循環，血栓形成區域逐漸變性壞死并干枯脫落，形成斷尾。與小鼠尾部血栓的發展相似，缺血性腦卒中病變后期由于長期的缺血缺氧，腦組織氧化應激明顯，并逐漸變性壞死，造成不可逆性病理損傷，使腦喪失正常生理功能，甚至于腦死亡[2，19]，同時腦部血栓的長度與缺血性腦卒中的嚴重程度具有明顯的正相關性。由此可見，小鼠尾部出栓率和血栓長度的變化不但可以直接體現正源抗栓蜜丸的抑制血栓作用，而且在一定程度上能夠說明正源抗栓蜜丸對于缺血性腦卒中的潛在療效。因此，在該研究中我們以小鼠黑尾率、小鼠尾部血栓長度以及小鼠尾部血栓相對長度作為關鍵指標，通過對比不同組別間上述指標的差異以確定正源抗栓蜜丸對于角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用，進而說明正源抗栓蜜丸治療缺血性腦卒中的潛能，這也與其他學者的研究相一致[12，15-16，20-21]。

實驗結果顯示，低、中劑量正源抗栓蜜丸均能顯著抑制小鼠尾部血栓形成，以中劑量效果最佳;同時高劑量正源抗栓蜜丸對小鼠尾部血栓形成的抑制作用反而不及低劑量有效，甚至與模型組無明顯差異（P>0.05）。我們認為可能是由于高劑量組小鼠的實際藥物攝入量較低劑量組更低。例如，過高濃度藥物的攝入刺激小鼠的胃部神經，使其反射性嘔吐，導致實際藥物攝入量降低。但我們在實際操作中并沒有明顯地觀察到這一現象。另一方面，這一反常現象可能與藥物自身特性有關，實驗中高劑量正源抗栓蜜丸藥物濃度可能位于倒“U”型濃度-作用曲線最適濃度的右側，與最適濃度間的距離甚至大于低劑量正源抗栓蜜丸，所以其抑制小鼠尾部血栓形成的效果不佳;再者，也可能是高濃度藥物抑制了小鼠對藥物本身的吸收或者促進其排泄。

綜上所述，一定濃度的正源抗栓蜜丸能夠明顯降低小鼠黑尾率、尾部血栓長度以及尾部血栓相對長度，顯著抑制角叉菜膠致小鼠尾部血栓。鑒于正源抗栓蜜丸組分的物質基礎研究[8-12]以及角叉菜膠致小鼠尾部血栓與缺血性腦卒中發病的相似性，我們認為正源抗栓蜜丸具有治療缺血性腦卒中的潛能，但具體療效如何，有待后續進一步探討。

參考文獻

[1]吳兆蘇，姚崇華，趙冬. 我國人群腦卒中發病率、死亡率的流行病學研究[J].中華流行病學雜志，2003（3）：71-74.

[2]安泳潼，夏玉葉，閔旸. 缺血性腦卒中的發病機制及其治療[J].世界臨床藥物，2010，31（1）：35-39.

[3]王凱華，黃龍堅，鄭光珊，等. 急性缺血性腦卒中的臨床研究進展[J].廣西中醫藥大學學報，2016，19（4）：72-76.

[4]王隴德，劉建民，楊弋，等. 我國腦卒中防治仍面臨巨大挑戰——《中國腦卒中防治報告2018》概要[J].中國循環雜志，2019，34（2）：105-119.

[5]朱德生，管陽太. 急性缺血性腦卒中抗栓治療策略[J].神經病學與神經康復學雜志，2019，15（1）：1-8.

[6]李萌青，王宇，張云云. 中藥注射劑治療急性缺血性腦卒中的臨床研究進展[J].中國中醫急癥，2019，28（6）：1112-1116.

[7]錢正瑤，劉蕾，王海博，等. 心腦康膠囊治療不穩定型心絞痛臨床觀察[J].中華中醫藥雜志，2016，31（6）：2433-2436.

[8]歐陽羅丹，胡小松，牛明，等. 基于網絡藥理學的水蛭活血化瘀的作用機制研究[J].中國中藥雜志，2018，43（9）：1901-1906.

[9]柳吉玲. 活血化瘀藥抗血栓作用的研究進展[J].中國當代醫藥，2013，20（35）：15-17.

[10]常明，葉勇，陽潔，等. 蝮蛇粉不同配伍方對老齡小鼠體內抗氧化的影響[J].蛇志，2018，30（1）：1-3，26.

[11]崔淑俠. 黃芪注射液對肺血栓栓塞癥及其溶栓后再灌注損傷的影響[D].武漢：武漢大學，2018.

[12]宋偉. 丹參新酮抗血小板作用及對血栓形成的影響[D].武漢：華中科技大學，2018.

[13]魏陵博，戎冬梅，吉中強，等. 角叉菜膠致大鼠尾部血栓形成的機制[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2008（5）：542-543.

[14]胡三覺，田巧蓮，顧建文，等. 一種新的體內血栓形成動物模型[J].第四軍醫大學學報，1993（1）：69.

[15]林曉堅，袁兆偉，潘彩燕，等. 紅景天苷對小鼠抗血小板活性和抗血栓作用[J].貴州醫科大學學報，2019，44（9）：1039-1043，1048.

[16]李寶芬，閆國強，董晶晶. 竺黃醒腦膠囊抗血栓形成作用的實驗研究[J].河北中醫，2017，39（9）：1364-1367，1390.

[17]劉彥霞，趙肖萌，溫宗妍，等. 角叉菜膠兩種給藥方式制備小鼠尾部血栓模型比較[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2013，11（7）：849-850.

[18]張俊林，劉旭海，孫萍.不同種類角叉菜膠誘導小鼠血栓模型的實驗研究[J].江西中醫學院學報，2013，25（2）：68-69.

[19]王永亭，曾麗莉，呂海燕，等. 缺血性卒中病因學與發病機制研究的十年進展[J].中國現代神經疾病雜志，2010，10（1）：2-27.

[20]曹文理，李菁. 重組水蛭素的抗血栓形成作用及其機制[J].中國應用生理學雜志，2018，34（4）：371-374.

[21]楊隆恩，張永平，張才，等. 海參酶解液對角叉菜膠所致小鼠血栓形成的抑制作用[J].廣東海洋大學學報，2018，38（4）：57-62.

（收稿日期：2020-06-02 編輯：劉 斌）